[发明专利]一种罗丹明6G的免疫亲合层析柱及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于食品安全领域中违禁添加剂检测分析技术领域。具体而言，本发明涉及一种罗丹明6G免疫亲合层析柱其制备方法及其用途。

发明背景

罗丹明是一系列邻苯二酚类的工业和生物染料，并具有较强的荧光，有罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明110等十几种产品。

罗丹明6G(Rhodamine 6G)，别名玫瑰红6G，对于人体及其他生物的毒性较大。通过与皮肤、黏膜的接触，吸入和经口而侵入人体。它与细胞原浆中蛋白质接触时发生化学反应，而使细胞失去活力，浓酚液能使蛋白质凝固。作用于蛋白质时，并不与之结合(此点与强酸、强碱不同)，所以能继续向深部组织渗透，引起深部组织损伤坏死，并被吸收而引起全身中毒。吸入高浓度的酚蒸气，可引起中枢神经系统障碍，经常暴露在酚浓度较低的空气中，也能引起皮炎，能使皮肤变黄褐色。

现场快速检测方法，也是使用非极性有机溶剂将其溶解并提取，提取液流过中性氧化铝固相萃取小柱吸附罗丹明6G，用非极性有机溶剂淋洗小柱，洗脱样品油脂和食品内源性干扰物，用肉眼可观测到在小柱上出现鲜亮的粉红色条带，判定为可疑样品。

免疫亲和层析技术是一种将免疫反应和层析技术相结合的分析方法，在提纯物质上是一项效率高、提纯物质纯度高、快速的技术，可以使免疫检测技术(如ELISA等)和层析技术在特异性、分离能力、速度和灵敏度方面得到互补，避免了免疫分析法直接测定样品的不足。

免疫亲和柱是上个世纪90年代在分析领域中得到应用的技术，但用免疫亲和柱串联氧化铝柱直接检测食品样品中的罗丹明尚未见报道。因此，本发明人通过大量试验，研制成功了一种具有高特异性和灵敏度且操作快捷的直接检测罗丹明6G免疫亲合层析柱。

发明内容

本发明目的是提供一种直接检测罗丹明6G的免疫亲合层析柱。

本发明的原理是根据抗原抗体的特异性反应和可解离的特性，用罗丹明抗体提取食品中的罗丹明6G残留，然后串联氧化铝柱，用其荧光直接检测罗丹明6G。

一方面，本发明提供了一种制备罗丹明6G免疫亲合层析柱的方法，该方法包括下列步骤：

a)将罗丹明6G特异性抗体与溴化氰活化的Sepherose4B胶混合，转鼓搅拌，偶联过夜；烧结玻璃滤器抽滤偶联胶，PBS洗脱未结合抗体，每次5毫升，洗4次；用1M乙醇胺封闭未结合位点，加过量乙醇胺孵育2.5小时，抽滤乙醇胺，用偶联缓冲液抽洗，然后再用HAC，Tris-Hcl缓冲液交替洗涤共4次，每次5ml；

b)将偶联后的胶装入亲和层析塑料柱中，装注1ml/柱，稍用力压紧，即得所述的罗丹明6G免疫亲合层析柱。

在本发明的一个优选实施方案中，所述的罗丹明6G免疫亲合层析柱的制备方法具体操作为：

取Sepherose 4B(100-120目)湿重4g(6ml)，用0.1M pH9.5Na₂CO₃溶液浸泡4小时。通风厨中称取溴化氰0.8g溶于1.2ml Na₂CO₃(2g溶液3ml缓冲液)，电磁搅拌10分钟。冰浴电磁搅拌下，将溴化氰溶液加入Sepherose4B中，2分钟内完成，滴加2N NaOH，使pH值保持在11，冰浴反应10分钟。

将反应后的Sepherose4B倒入布氏漏斗中，用预冷的Na₂CO₃溶液4-10℃洗2-3分钟内完成，抽洗25倍体积的液体准备交联蛋白。

4℃下，将实施例1制备的抗体(多克隆或单克隆抗体)溶液与溴化氰活化的Sepherose4B胶混合，转鼓搅拌，偶联反应过夜。

烧结玻璃滤器抽滤偶联胶，PBS洗脱未结合抗体，每次5毫升，洗4次。分别测定抗体含量。

用1M乙醇胺(ethanolamine)封闭未结合位点，加过量乙醇胺孵育2.5小时。抽滤乙醇胺，用偶联缓冲液抽洗。然后再用交替的HAC，Tris-Hcl缓冲液洗4次，每次5ml。

最后，将偶联后的胶装入亲和层析塑料柱中，装注1ml/柱，稍用力压紧，即得到本发明所述的罗丹明6G免疫亲合柱。

另一方面，本发明提供了一种罗丹明6G免疫亲合层析柱，该免疫亲合层析柱包括偶联有罗丹明6G特异性抗体的Sepharose4B与装载该亲和材料的塑料柱，以及与此亲和材料塑料柱串联的氧化铝柱。