[发明专利]一种核苷酸和/或寡核苷酸及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种核苷酸和/或寡核苷酸及其制备方法。 

背景技术

化学合成寡核苷酸是指通过促使核苷酸单体间形成5’-3’磷酸二酯键，从而将多个核苷酸单元连接为寡核苷酸链的过程，其中涉及保护的核苷酸的合成。 

目前通用的寡核苷酸合成方法采用的是固相合成法，首先将核苷酸上的5’-OH用二对甲氧三苯甲基(DMT)保护，碱基上的氨基用苯甲酰基保护，3’-OH用氨基亚磷酸化合物进行活化。将第一个核苷酸的3’-OH与固相树脂结合在一起，并脱去5’-OH上的保护基，使裸露的5’-OH与第二个核苷酸的用氨基亚磷酸化合物进行活化的3’-OH之间形成一个亚磷酸三酯，亚磷酸三酯经碘氧化形成磷酸三酯，再加入三氯乙酸除去第二个核苷酸的5’-OH上的保护基。至此，寡核苷酸链已经延伸了一个核苷酸单元，并可投入下一轮延伸反应。经过若干轮的延伸反应，整个寡核苷酸片段合成完毕之后，用浓氢氧化铵将寡核苷酸片段从固相树脂上洗脱下来，经过脱保护和纯化得到寡核苷酸。 

上述固相合成法的优点在于：1)自动化，合成反应全部由合成仪自动完成；2)合成周期短；3)产率高，单步的缩合反应一般产率大于98％。但是固相合成法也存在一些缺点：1)合成规模小，目前较大规模的固相合成规模一般不超过100微摩尔，远远满足不了用于药物原料的要求；2)难于达到高纯度，由于合成方法的限制，得到的寡核苷酸不可避免的含有碱基数N-1，N-2等非目标的寡核苷酸片段，这对于药物应用是十分不利的；3)浪 费严重，为充分反应，每个合成循环中，往往需加入数倍于反应实际消耗量的亚磷酰胺单体以达到过量，且循环结束后需使用大量有机溶剂作为冲洗溶剂，洗去未反应的亚磷酰胺单体，4)成本高，反应所需的固相载体和亚磷酰胺单体价格昂贵，使合成的寡核苷酸成本高昂。 

因为寡核苷酸在生命活动中的重要功能和目前核酸研究技术的高速发展，尤其是RNA干扰技术的发展及其潜在的临床应用价值，大规模寡核苷酸的合成意义十分重大。 

发明内容

本发明的目的是为了克服目前的寡核苷酸合成方法的合成规模小、成本高等缺点，提供一种能够大规模合成寡核苷酸的方法。 

本发明提供了一种式(1)所示的核苷酸和/或寡核苷酸： 

式(1) 

其中，R为氢或R₁，R₁表示三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二对甲氧三苯甲基或三甲氧基三苯甲基； 

n为1-100的整数； 

B表示环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，且各个重复 单元中的B相同或不同； 

R₂表示位阻型硅烷结构的基团； 

R₃表示卤素原子、硝基或甲氧基。 

其中，所述位阻型硅烷结构的基团可以为叔丁基二甲基氯硅甲烷基、苯基二甲基氯硅甲烷基、叔丁基二苯基氯硅甲烷基或三异丙基氯硅甲烷基。 

其中，所述酰基可以为苯甲酰基、异丁酰基或乙酰基；卤素原子可以为氯或溴。 

本发明提供的式(1)的化合物中，当R为H时，式(1)与如下所述的x大于等于1时的式(2)等价；当R为R₁时，式(1)与如下所述的式(4)等价。 

本发明还提供了一种液相合成核苷酸和/或寡核苷酸的方法，其特征在于，该方法包括在缩合剂存在下，在缩合反应条件下，使式(2)的化合物与式(3)的化合物在第一液态反应介质中接触，得到式(4)的化合物； 

式(2) 

式(3) 

式(4) 

其中， 

x为0-50的整数；y为1-50的整数； 

B₁和B₂各自表示环外氨基被酰基保护的鸟嘌呤基、环外氨基被酰基保护的腺嘌呤基、环外氨基被酰基保护的胞嘧啶基、胸腺嘧啶基或尿嘧啶基，且各个重复单元中的B₁或B₂相同或不同； 

R₁、R₂和R₃的定义如式(1)中所述； 

A⁺表示三烷基铵离子或二烷基铵离子。 

本发明提供的方法得到的脱去保护基的寡核苷酸，可以具有生物活性，可以用于各种寡核苷酸的用途，例如RNA干扰。