[发明专利]硅胶表面分子印迹棒曲霉素特异性聚合物制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物检测技术领域的聚合物制备方法与应用，尤其是一种可作为苹果汁及相关产品中痕量棒曲霉素液相色谱检测分析的硅胶表面分子印迹棒曲霉素特异性聚合物制备方法与应用。

技术背景

棒曲霉素主要是由青霉属、曲霉属等真菌产生的有毒次级代谢物。近来，苹果汁中的棒曲霉素因其毒副作用，其检测技术成为国内外研究的热点。如根据检索发现中国专利申请号：CN03160299.1，名称：展青霉素免疫层析检测试纸的制作方法与应用，该技术称：快速检测方法。该发明的检测试纸，包括衬垫，样品垫，示踪粒子结合物垫，硝酸纤维素膜，吸水垫，检测线，质控线；在衬垫上按顺序有样品垫，示踪粒子结合物垫，硝酸纤维素膜，吸水垫；示踪粒子结合物垫上有示踪粒子标记的抗展青霉素的抗体，硝酸纤维素膜上还设有检测线和质控线，检测线上有展青霉素检测抗原，质控线上有抗抗体，其中抗抗体是抗展青霉素的抗体的抗体。其优点是有放射免疫分析和酶联免疫吸附试验ELISA的优点；同时，该发明有简单、快速、常温保存、单份测定、一次试验测出展青霉素、除商品试剂外不需任何仪器设备的优点，特别适合展青霉素的现场快速检测。

与其他真菌毒素不同，现在还没有商品化的棒曲霉素ELISA试剂盒，关键问题是作为小分子的棒曲霉素很难制作特异性理想的抗体，尽管在研究上有所尝试，但都处于实验室阶段。目前，棒曲霉素检测的常见方法包括薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)。其中，HPLC结合紫外或荧光检测器分析检测棒曲霉素已经逐渐成为常规的方法。然而，传统的HPLC方法的样品处理方法以及产品中因加热等因素所产生的共存的干扰物5-羟甲基糠醛严重影响了棒曲霉素检测的速度和准确性。所以开发快捷、方便并具有较高特异性的样品处理方法结合常规的HPLC仪器检测分析果汁样品中棒曲霉素已经非常必要。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种硅胶表面分子印迹棒曲霉素特异性聚合物的制备方法，作为苹果汁及相关产品中痕量棒曲霉素液相色谱检测分析的前处理聚合物或基质材料，不仅特异性富集样品中痕量待检成分，而且还避免了由传统液-液萃取方法碱洗除杂和旋蒸去除有机溶剂步骤造成的回收率损失，降低了有机溶剂的使用量。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及的硅胶表面分子印迹棒曲霉素特异性聚合物制备方法，包括以下步骤：

①首先，硅胶表面预处理；

②通过硅胶表面硅烷化制备3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)-硅胶，引入氨基；

③通过两种方法在硅胶表面接枝上偶氮引发剂，制备ACPA[4，4’-Azobis(4-cyanopentanoic acid)，4，4’-偶氮-(4-氰戊酸)]-硅胶；

④以棒曲霉素结构类似物2-羟基烟酸作模板替代分子，以丙烯酰胺、甲基丙烯酸、4-乙烯基吡啶、三氟甲基丙烯酸为功能性单体，以二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)为交联剂，在乙腈、吡啶溶剂中通过热引发途径获得硅胶表面分子印迹聚合物；

步骤①中所述的预处理，其方法为：取微孔硅胶20g，用10％盐酸回流洗涤6h或50％硝酸浸泡24h，以除去硅胶中的少量无机杂质并增加硅胶表面羟基数目。去离子水洗至中性后，用丙酮洗涤去除硅胶中的有机物质。110℃烘干后于充满氮气的干燥器中保存。

步骤②中所述的APTS-硅胶，其制备方法为：

取2g活化硅胶分散于25ml甲苯中，加入1mlAPTS，氮气保护下105℃下搅拌回流反应6h；反应结束后过滤，依次用甲苯、乙醚洗涤，室温下真空干燥至恒重。

接枝后APTS-硅胶的N、C、H元素分析，即三个元素含量的增加，可以帮助判断接枝是否成功。正常硅胶原料或活化硅胶中不含有N、C元素。

步骤③中所述的ACPA-硅胶，其制备方法为：

采用两种途径制备ACPA-硅胶：

A：酰氯中介法：

首先，ACPC[4，4’-Azobis(4-cyanopentanoic acid)chlorides，4，4’-偶氮-(4-氰戊酸)酰氯]的制备，其制备方法为：