[发明专利]检测多种鱼类病原的基因芯片及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于海洋生物的病原的分子生物学检测领域，具体涉及一种检测多种鱼类病原的基因芯片及其检测方法。

背景技术

目前，病原微生物检测方法的报道有很多，除了传统的生理生化检测之外，还有免疫学检测如间接荧光抗体技术、核酸印迹杂交及PCR检测等方法。传统的生化鉴定操作繁琐、且需要数天才能得到结果；免疫学方法荧光抗体技术从制样到完成检测只需3～4h，缺点是免疫检测需要制备抗血清；探针杂交技术也存在特异性和灵敏度的问题；常规PCR方法一次只能检出一种致病微生物，而对多种病原感染的样品则显的无从下手。

新近发展起来的基因芯片技术达到在同一个支持物上对多种病原同时进行检测和鉴定的目的，不但大大缩短了检测时间，而且能够提高灵敏度和准确率，弥补了其它分子生物学检测手段的不足。国内在基因芯片技术应用于水产动物疾病检测上也进行了尝试，但尚未见应用该技术同时对鱼类病毒类、原生动物类和鱼立克次氏体等多种病原微生物进行检测的相关基因芯片应用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测多种鱼类病原的基因芯片及其检测方法，用于检测淋巴囊肿病毒、流行性造血器官坏死症病毒、鱼细胞肿大病毒、石斑鱼虹彩病毒、病毒性神经坏死病毒RGNNV型、病毒性神经坏死病毒BFNNV型、病毒性神经坏死病毒SJNNV型、病毒性神经坏死病毒TPNNV型、病毒性神经坏死病毒TNV型、传染性造血器官坏死症病毒、病毒性出血败血症病毒、传染性胰脏坏死病病毒、獅鱼病毒性腹水病毒、传染性鲑鱼贫血病毒、淀粉卵涡边虫、三代虫和鱼立克次氏体共17类鱼类病原，以弥补现有技术的不足。

本发明的技术方案包括

一、基因芯片的构建

1、基因芯片上的探针选择

本发明共提供了两大类探针，1)质控体系的探针，包括表面化学质控的探针、阴性对照质控的探针以及杂交阳性外对照质控探针和整个流程监控的阳性内对照质控的探针，同时提供各探针对应的正向引物及反向引物；2)用于检测淋巴囊肿病毒等17类鱼类病原微生物的探针，同时提供各探针对应的正向引物及反向引物。

质控体系各成员，包括表面化学质控、阴性对照质控、杂交阳性外对照质控、整个流程监控的阳性内对照质控的探针引物序列及各病原微生物的探针及其序列信息如下：

(1)表面化学质控QC1探针P序列、正向引物F序列和反向引物A序列分别对应于表1中的序号1、2和3；阴性对照质控QC4探针P序列对应于表1中序号4；杂交阳性外对照质控QC2探针P序列、正向引物F序列和反向引物A序列分别对应于表1中序号5、6和7；整个流程监控的阳性内对照质控QC3探针P序列、正向引物F序列和反向引物A的序列分别对应于表1中序号8、9和10；

表1：质控体系的探针及引物序列信息

其中：“F”表示正向引物序列；“A”表示反向引物序列；“P”表示探针序列；

(2)淋巴囊肿病毒探针序列P、正向引物序列F1、反向引物序列A1、正向引物序列F2和反向引物序列A2分别对应于表2中序号1、2、3、4和5；

(3)流行性造血器官坏死症病毒探针序列P、正向引物序列F1、反向引物序列A1、正向引物序列F2和反向引物序列A2分别对应于表2中序号6、7、8、9和10；

(4)鱼细胞肿大病毒探针序列P、正向引物序列F1、反向引物序列A1、正向引物序列F2和反向引物序列A2分别对应于表2中序号11、12、13、14和15；

(5)石斑鱼虹彩病毒探针序列P、正向引物序列F、反向引物序列A1和反向引物序列A2分别对应于表2中序号16、17、18和19；石斑鱼虹彩病毒另一个探针序列P3、正向引物序列F3和反向引物序列A3分别对应于表2中序号20、21和22；

(6)病毒性神经坏死病毒RGNNV型特征基因探针序列P1、正向引物序列F1和反向引物序列A1分别对应于表2中序号23、24和25；病毒性神经坏死病毒RGNNV型特征基因探针序列P2、正向引物序列F2和反向引物序列A2分别对应于表2中序号26、27和28；

(7)病毒性神经坏死病毒BFNNV型特征基因探针序列P1、正向引物序列F1和反向引物序列A1分别对应于表2中序号29、30和31；病毒性神经坏死病毒BFNNV型特征基因探针序列P2、正向引物序列F2和反向引物序列A2分别对应于表2中序号32、33和34；