[发明专利]在重组大肠杆菌中生产人的类胰岛素生长因子-1的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术中的生物医药领域，尤其涉及一种应用DNA重组技术，即构建硫氧还蛋白和hIGF-1融合蛋白，利用大肠杆菌宿主菌Rosetta-gami(DE3)来表达制备hIGF-1融合蛋白，并利用肠激酶切割融合蛋白最终得到hIGF-1的方法。

背景技术

人的类胰岛素生长因子-1(hIGF-1)是由70个氨基酸组成的单链蛋白，含三个二硫键。它的结构、生物学性质和化学性质与胰岛素有相似之处，故称为类胰岛素生长因子。有关研究表明，hIGF-1具有促进生长发育和物质代谢等作用，因此像骨骼生长、细胞复制和另外一些与生长相关的过程均受IGF-1的影响。为此，IGF-1倍受重视，在治疗胰岛素抗性糖尿病、神经损伤、矮小症、骨质疏松、分解代谢疾病等方面，具有广阔的应用前景。

到目前为止，包括大肠杆菌，酵母，无细胞体系，转基因植物和动物在内的一系列表达体系已经被用于表达hIGF-1。在大肠杆菌中hIGF-1的产量达到了8.5g/L，但是90％都是以包涵体形式存在的。在酵母中hIGF-1的表达量只有55mg/L。相似的，hIGF-1的表达量在转基因植物和动物中也很低。最近实验发现在大肠杆菌无细胞体系中，可溶性hIGF-1的产量达到了400mg/L，但是无细胞体系的高昂费用阻止了hIGF-1的大规模生产。因此提高hIGF-1的可溶表达迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种在重组大肠杆菌中的高效生产人的类胰岛素生长因子-1的方法，该方法高效可溶表达，稳定存在，分离方法简单，成本低，适用于大规模生产hIGF-1。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种在重组大肠杆菌中生产人的类胰岛素生长因子-1的方法，该方法包括以下步骤：

(1)设计和合成hIGF-1蛋白相关基因：设计上下游引物，并合成hIGF-1基因，合成的hIGF-1基因具有SEQ ID NO.1所示的基因序列；

(2)构建hIGF-1融合蛋白表达载体；

(3)用表达载体转化大肠杆菌宿主构建基因工程菌；

(4)用基因工程菌表达hIGF-1融合蛋白；

(5)亲和层析分离纯化hIGF-1融合蛋白；

(6)用肠激酶切去hIGF-1融合蛋白的融合标签；

(7)阳离子交换分离纯化。

本发明的有益效果是：由于大肠杆菌菌株Rosetta-gami(DE3)携带有氯霉素抗性的质粒，它能够提供编码AGG，AGA，AUA，CUA，CCC和GGA稀有密码子的tRNA，因此可以有效消除成熟的hIGF-1(含有4个AGG，2个CCC和1个CUA稀有密码子)在大肠杆菌中稀有密码子的负面影响；同时该菌株将trxB和gor两条主要还原途径双突变，因此它可以促进hIGF-1融合蛋白二硫键的形成，提高目标蛋白的可溶表达。本发明采用串联表达的融合蛋白，N端为硫氧还蛋白，C端为hIGF-1，使表达产物更加稳定，分离方法简单，价廉。经过发酵条件优化后，可溶性hIGF-1融合蛋白的产量达到了2.06g/L。因此，本发明具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是pET32-hIGF-1质粒构建图；

图2是在Rosetta-gami(DE3)/pET32-hIGF-1中，不同表达温度对目标蛋白表达的影响的图，其中，(a)为可溶蛋白，(b)为不可溶蛋白；

图3是在Rosetta-gami(DE3)/pET32-hIGF-1中，诱导时间对目标蛋白表达的影响图，1、3、5分别代表在对数生长期前期、中期、后期和稳定期诱导的可溶蛋白；2、4、6代表相应的不可溶蛋白；

图4是亲和纯化后收集的洗脱样品的SDS-PAGE电泳图，1为纯化前样品，2为洗脱样品，3为纯化后的目标蛋白；

图5是肠激酶消化后的SDS-PAGE电泳图，1为肠激酶切割后的hIGF-1融合蛋白，2为肠激酶切割前的hIGF-1融合蛋白。

具体实施方式

本发明相关基因的结构特点是组成融合蛋白的两个蛋白分别是硫氧还蛋白和hIGF-1，硫氧还蛋白可以促进hIGF-1二硫键形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出现的可能性增加；hIGF-1基因序列在第69个氨基酸末端连接有两个终止子顺序TAA和TGA，使得蛋白的表达更有效的得以终止。两个蛋白之间引入含6个组氨酸标签，大大方便了该蛋白的分离纯化。

本发明人的类胰岛素生长因子-1(hIGF-1)的高效生产方法采用基因工程菌发酵法生产，包括以下步骤：