[发明专利]一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法

权利要求书

1.一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法，其特征是：

按以下步骤实施杂交育种：

(1)采用CTAB法提取国兰DNA基因组；

(2)筛选国兰ISSR引物；

(3)用筛选出的引物由PCR扩增国兰杂交亲本；

(4)待选杂交亲本亲缘关系聚类分析；

(5)结合待选杂交亲本形态表现和亲缘关系选定杂交亲本，制定杂交策略；

(6)培育亲本着花，采收父本花粉，与母本人工授粉；

(7)培育授粉后的胚珠至发育的果荚成熟。

2.根据权利要求1所述的一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法，其特征是：所述的CTAB法提取国兰DNA基因组，其步骤是：

1)称取供试国兰幼嫩叶片50mg，在液氮中研磨三至四次，将粉末放入2ml离心管，加入800μl 2×CTAB提取缓冲液于其中，65℃水浴约1小时，每隔15分种颠倒混匀数次；

2)待样品冷却到室温加入氯仿∶异戊醇为24∶1的溶液800μl，颠倒混匀，12000rpm离心15min；

3)取上清液到新的2ml离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇为24∶1的溶液，上下颠倒混匀，12000rpm离心15min；

4)第二次取上清液到新的2ml离心管中，加入等体积的异戊醇，颠倒混匀后，-20℃静置，沉淀30min；12000rmp离心15min，去上清液；

5)500μl75％乙醇洗涤沉淀，12000rmp离心10min，洗涤两次；

6)去上清液，室温晾干，无残留乙醇，加入约100μl灭菌水溶解DNA；

7)0.8％琼脂糖电泳检测。

3.根据权利要求1所述的一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法，其特征是：

所述的由PCR扩增国兰杂交亲本是在PCR仪上进行PCR扩增反应，反应体系共20μl，包括10×Buffer 2μl、1.0mmol/L dNTP、1.2U Taq polymerase、1.5μmol/LISSR引物、模版100ng，用ddH2O补齐20μl；所述的PCR扩增反应是由PCR扩增程序实现，所述的PCR扩增程序是：94℃预变性360s，然后94℃变性70s，52℃退火复性50s，72℃延伸70s，40个循环；72℃延伸420s，4℃终止反应；PCR产物在含有0.5μg/mL EB的2.0％琼脂糖凝胶中电泳1h，通过凝胶成像系统获取电泳凝胶图像，进行拍照分析；引物807、811、812、825、827、835、840、862、866、880用于上述ISSR-PCR体系，扩增出的条带清晰，多态性高。

4.根据权利要求1所述的一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法，其特征是：

所述的待选杂交亲本亲缘关系聚类分析，是利用ISSR分子标记结果，分析亲本之间的亲缘关系，采用人工读带，同一引物、同一位点按其扩增产物的有表示为(1)，无表示为(0)得到二元资料，形成0、1矩阵，利用NTSYS统计软件的UPGMA法构建不同种之间的分子系统树，并计算种间的遗传相似系数；根据杂交亲本的形态表现及育种目标，选定抗逆性强、观赏性高、适应性广且亲缘关系较近的品种作为亲本。

5.根据权利要求1所述的一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法，其特征是：

所述的培育亲本着花，是在新生苗的终止叶出现后但尚未完全展开之前，将氮∶磷∶钾比例为7∶9∶16的花肥按照1∶1000比例溶于水，从兰花根部施浇，每周一次，并在兰花耐受范围之内，在白天保证足够的光照并增加昼夜温差，促进花芽分化；

花芽分化后，将氮∶磷∶钾比例为25∶5∶20的花肥按照1∶1000比例溶于水之后，从兰花根部施浇，每周一次直至着花。

6.根据权利要求1所述的一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法，其特征是：

所述的与母本人工授粉，其步骤是：所选亲本开花后1-2天，在晴天上午进行，轻轻拨掉药帽，再用干净镊子将雄花花粉块送入雌花合蕊柱分泌粘液的药腔内。