[发明专利]一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法

说明书

技术领域

属于生物育种技术领域，确切地说是涉及一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法。

背景技术

兰属(Cymbidium)是兰科(Orchidaceae)植物中最早引入栽培的属之一。国兰狭义地指兰属中的五种地生种：春兰Spring Orchid(C.goeringii)、建兰AutumnOrchid(C.ensifolium)、寒兰Winter Orchid(C.hanran)、墨兰Dark Orchid(C.sinense)和惠兰Fragrant Orchid(C.faberi)，其香气馥郁、色泽淡雅，花姿秀美，叶态飘逸。

我国具有非常丰富的国兰原生种和栽培品种，其种质资源相当丰富，蕴藏有极为丰富的优良基因，但在新品种培育中尚未得到开发利用。目前，对于国兰的研究主要集中在快速繁殖方面，利用茎尖、茎段、花梗、叶片、花瓣、根段等作为外植体进行组织培养的研究有较多的文献资料，而杂交育种工作国内的报告很少，几乎没有开展。目前，国兰的品种培育仍然主要依靠从野生植株中选择的传统观念和做法，兰花的人工新品种培育工作一直没能得到应有的重视，人工培育的具有经济价值的新品种则少之又少，在花卉新品种的培育中(包括农林园艺的其它作物)很少有像国兰这样仍从野生变异中选择品种的做法，国兰新品种培育的道路应当是宽广的。

杂交育种是培育兰花新品种最重要的方法，兰花在种内或种间，甚至与其他兰属植物进行杂交都可能获得杂交后代。传统国兰在花色、瓣型、香味方面具有极大的优势，通过杂交将这些优良基因转入到国兰的新品种中来，必定能培育出优秀的国兰新品种。从长远来看，兰属内的广泛杂交育种必然会出现。

发明内容

本发明的目的是提供可以大大提高亲本选择效率，加快育种进程，促进国兰种质资源创新的一种利用分子标记进行国兰杂交育种的方法。

本发明采取的技术方案：

按以下步骤实施杂交育种：

(1)采用CTAB法提取国兰DNA基因组；

(2)筛选国兰ISSR引物；

(3)用筛选出的引物由PCR扩增国兰杂交亲本；

(4)待选杂交亲本亲缘关系聚类分析；

(5)结合待选杂交亲本形态表现和亲缘关系选定杂交亲本，制定杂交策略；

(6)培育亲本着花，采收父本花粉，与母本人工授粉；

(7)培育授粉后的胚珠至发育的果荚成熟。

实施本发明后的积极效果是：

为人工选育国兰的品种创造出崭新途径；而不必要再从野生植株中选择。本方法可以大大提高亲本选择效率，加快育种进程，促进国兰种质资源的创新。本发明的ISSR标记技术具有多态性水平高，操作简单，重复性好和稳定性高等特点，能够检测出丰富的遗传多样性。且可以在分子水平上，比较直观的选择遗传距离合适，表现型良好的杂交亲本，以提高杂交的成功率。

具体实施方式

现对本发明作进一步说明

按以下步骤实施杂交育种：

(1)采用CTAB法提取国兰DNA基因组；

(2)筛选国兰ISSR引物；

(3)用筛选出的引物由PCR扩增国兰杂交亲本；

(4)待选杂交亲本亲缘关系聚类分析；

(5)结合待选杂交亲本形态表现和亲缘关系选定杂交亲本，制定杂交策略；

(6)培育亲本着花，采收父本花粉，与母本人工授粉；

(7)培育授粉后的胚珠至发育的果荚成熟。

1.所述的CTAB(Cetyltrimrthyl ammonium-bromide，十六烷基三甲基溴化铵)法提取国兰DNA基因组，其步骤是：

1)称取供试国兰幼嫩叶片50mg，在液氮中研磨三至四次，将粉末放入2ml离心管，加入800μl 2×CTAB提取缓冲液于其中，65℃水浴约1小时，每隔15分钟颠倒混匀数次，以使其充分裂解；

2)待样品冷却到室温加入氯仿∶异戊醇为24∶1的溶液800μl，颠倒混匀，12000rpm离心15min；

3)取上清液到新的2ml离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇为24∶1的溶液，上下颠倒混匀，12000rpm离心15min；

4)第二次取上清液到新的2ml离心管中，加入等体积的异戊醇，颠倒混匀后，-20℃静置，沉淀30min；12000rmp离心15min，去上清液；

5)500μl75％乙醇洗涤沉淀，12000rmp离心10min，洗涤两次；

6)去上清液，室温晾干，无残留乙醇，加入约100μl灭菌水溶解DNA；