[发明专利]同时检测人CMV和BK病毒DNA的引物序列及定量检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术，是一种基于定量核酸扩增的分子生物学方法，特别是涉及用实时荧光定量多聚酶链反应(real-time PCR)，通过使用特异性的引物扩增巨细胞病毒(CMV)和多瘤病毒(BKV)保守性片段，并通过特异性探针释放荧光信号对其进行定量。优化实验条件后，构建可在单个反应管内同时完成对CMV DNA和BKV DNA检测的试剂盒。 

背景技术

CMV和BKV是肾移植受者体内的潜伏病毒。当免疫抑制治疗过度时，两种病毒会有不同程度的再激活而损伤移植肾脏。这些病毒可以在肾移植受者尿液、血浆和外周血细胞中被发现，对肾移植受者的长期存活、移植肾的长期存活和医疗费用产生巨大的负面影响。 

目前，还未开发出可同时检测CMV DNA和BKV DNA的诊断试剂，作为早期指标诊断CMV和BKV感染。而且对肾移植受者免疫过度抑制的评价和危害也未有具体的方法。CMV和BKV作为潜伏病毒，可以作为肾移植受者体内的“探针”，检测两种病毒DNA的拷贝数变化可间接反应机体免疫抑制程度。 

本发明基于实时荧光定量PCR技术，利用此技术的敏感性和特异性，针对CMV DNA和BKVDNA的保守序列设计了荧光定量PCR的引物和标记荧光的探针。通过不同荧光标记探针，可以在同一反应管和同次实验内完成对CMV DNA和BKV DNA的检测。并通过制备含CMV和BKV靶DNA的标准品，使荧光定量PCR可以同时定量检测CMV DNA和BKV DNA拷贝数。目前，尚无其他方法可同时对CMV、BKV两种病毒的DNA进行定量检测。 

发明内容

本发明的目的是克服现有分子诊断技术中对CMV和BKV DNA序列多态性考虑不足，提供了一种用于对CMV和BKV DNA保守性序列进行定量检测的引物和探针，包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5和SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6。 

本发明第二个目的是提供CMV DNA和BKV DNA的保守序列作为检测的靶DNA片段SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8。 

本发明第三个目的是提供一种配套此引物和探针检测CMV DNA和BKV DNA的标准品，其为含CMV、BKV两种测定目的DNA片段SEQ ID NO.9的纯化质粒，并提供了制备标准品的引物SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12到SEQ ID NO.13。 

本发明第四个目的是提供一种简便的对临床标本的CMV DNA和BKV DNA同时进行定量检测的试剂盒。 

本发明的技术方案概述如下： 

一组用于扩增CMV和BKV的特异性引物和探针，分别针对CMV保守序列和BKV的保守序列。针对CMV有上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2，及一条探针SEQ ID NO.3；针对BKV有上游引物SEQ ID NO.4和下游引物SEQ ID NO.5，及一条探针SEQ ID NO.6。 

提供CMV DNA和BKV DNA的保守序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8作为检测的靶DNA片段，其具有高度的保守性。 

一种配套此引物和探针检测CMV DNA和BKV DNA的标准品，其为含CMV、BKV两种测定目的DNA片段SEQ ID NO.9的纯化质粒。CMV DNA片段经引物对SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11扩增而获得，其BKV DNA片段经引物对SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13扩增而获得。标准品通过基因工程技术将包含检测CMV和BKV的目的DNA片段连接到质粒上，并通过鉴定、扩增、提取、纯化获得，并通过260nM的进行吸光度值读取，进行浓度分析而获得目的DNA准确的拷贝数目，并通过稀释制备成不同浓度的标准品。 

一种同时检测CMV和BKV两种病毒DNA的试剂盒： 

试剂A：由针对CMV、BKV的引物和探针混合组成250μL溶液。溶液包含5μM SEQ ID NO.1、5μM SEQ ID NO.2、5μM SEQ ID NO.4、5μM SEQ ID NO.5和2μM探针SEQ ID NO.3、2μM探针SEQ ID NO.6；