[发明专利]玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法，属于玉米抗病性鉴定技术领域。

背景技术：

玉米丝黑穗病是世界性的重要玉米病害。在国外最早报道见于1875年，亚、非、欧洲各国家均有不同程度发生，给玉米生产带来一定的经济损失(王远路，2005)。该病在我国各玉米产区均有不同程度的发生，其中以北方春播区、西南丘陵山地区受害较重，一般发病率在5％～10％之间，个别重病地块发病率可达60％～70％以上。

可通过加强田间管理降低玉米丝黑穗病发病率，也可采用种子包衣等药剂防治措施使发病程度得到控制，但这些方法受气候和人为操作影响较大，稳定性不足，成本高，易造成感病和严重的减产，药物使用不当容易对玉米造成毒害，易污染环境，而且不同的品种间对玉米丝黑穗病的抗性存在极显著的差异。防治该病最有效的方法是种植抗病玉米品种，而抗病品种的选育依赖于抗病种质资源，为此需加强对玉米种质资源进行该病的抗性评价，进而选育抗病玉米自交系。

由于玉米丝黑穗病从种子萌发到七叶期都能侵染，并且各时期表现不同的特征，因此该病的抗性鉴定方法较多。主要包括：质壁分离法、接种后在乳熟期进行鉴定、乳酚油棉兰染色玉米生长锥鉴定法、丁布含量测定方法、叶片褪绿斑的有无鉴定法、通过观察生长锥中菌丝进行鉴定、PCR技术的玉米丝轴黑粉菌侵染率。其中，乳熟期进行田间菌土法鉴定是目前通用的鉴定方法(Kruger W，1962)，具体方法为：从上一年秋季的典型病株上采集病瘿，装布袋、置通风处越冬；播种前一周将病瘿上的菌粉抖落，用40目的筛子筛出冬孢子，按0.1％质量比与晒过的细土混合配成菌土；播种时先播种子，覆盖菌土100g，上面再上一层覆土，等玉米生长到乳熟期进行病株率调查。虽然鉴定结果相对准确可靠，但是存在一定的局限性：用地量大，需要时间长，要求材料纯度高，鉴定群体量大一般不少于50株，同时需在多年多点多个环境进行鉴定。通过观察生长锥中菌丝进行鉴定目前有6种常用的染色法，并且，张宝艳(2008)比较了姬姆萨氏色素(Giemsa)、考马斯亮兰组织透明染色、番红O-KOH、苯胺蓝-甘油、曲利苯兰酒精-乳酚酸和苯胺蓝-乳酚油染色法对玉米丝黑穗病菌不同生长发育阶段的染色效果。结果表明，在一定的染液浓度条件下，6种染色方法均可进行冬孢子、芽管、先菌丝、担子、担孢子等寄主组织内部菌体的原位染色。曲利苯兰组织透明染色方法更稳定、简捷和易于观察，能观察玉米丝黑穗病菌的整个生长发育阶段，因此适宜胞间菌丝的染色。此法对丝黑穗的鉴定也比较准确，每次鉴定的量少，并且，据檀国庆(2009)报道，发现玉米在接种后有带菌现象，即植物体内有菌丝存在但在乳熟期不发病。因此，这种状况就很难判断。

上面的每种方法都有其优点和局限性，如利用在苗期侵染叶片所产生的褪绿斑点来鉴定抗病性的方法仅适用于自交系且判断不准确；而乳熟期鉴定结果虽然准确可靠，但用地量大，工作效率低，群体不少于50株，同时需在多个环境鉴定，因此需要寻求一种能在室内准确快速鉴定资源抗性的方法。

发明内容：

本发明的目的是针对上述存在的问题提供一种玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法，达到建立简便、快速、有效、准确的使用少量材料即可进行玉米丝黑穗病接种鉴定的目的。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法，该方法包括如下步骤：

(1)制备玉米丝黑穗病菌菌液：玉米丝黑穗病菌冬孢子粉在室温下干燥6-7天，无菌水清洗，甲醛+高锰酸钾熏蒸25min，接种至麦芽糖水琼脂培养基，28℃下倒置暗培养17h，挑取已经萌发的单个冬孢子，接种至马铃薯葡萄糖培养基，28℃下倒置暗培养15d，将培养好的丝黑穗病菌的菌落刮出，转入2％的蔗糖溶液中，28℃下振荡暗培养48h，调整菌液浓度为6.2×105cfu/ml；

(2)培养玉米幼苗：挑选发育良好玉米种子，放入铺好滤纸的发芽盒中，喷水后放入人工气候箱中，20℃下进行暗培养，直至芽长到3cm；

(3)接种玉米丝黑穗病菌：将步骤(2)中培养的玉米幼苗的中胚轴部位侵入步骤(1)中制备好的玉米丝黑穗病菌菌液中，放入真空干燥器中，盖上盖子，打开真空泵，压力为6X10^-2帕处理25-35min将玉米幼苗取出，接种温度为25℃/15℃变温处理；

(4)接种后幼苗的培养：在接种后苗移栽到土壤，保证土壤湿度稳定在20％；