[发明专利]禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性基因型的分型检测方法

权利要求书

1.禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)多菌灵抗性菌株基因型的分子检测和分型方法，其特征在于采用Tetra-primer ARMS PCR(Tetra-primer Amplification Refractory Mutation System-PCR)技术快速、准确地检测出田间具有多菌灵抗性基因的抗药性禾谷镰孢菌菌株，并对抗药性基因进行SNP分型。

禾谷镰孢菌具有抗多菌灵基因的菌株检测方法，共分三步：

第一步：采用常规的苯酚·氯仿·异戊醇法，分别提取待测样品的核基因组DNA。

第二步：运用三组引物对，进行PCR反应，获得三组PCR产物。

PCR反应体系及扩增程序：

(1)氨基酸167位扩增：

反应体系：

PCR buffer(10×)            2.5μL

dNTP(2.5mM each)            2μL

MgCl₂(25mM)                 1.5μL

F-out167/R-out167(10μM)    各0.2μl

F-in167T(10μM)             0.5μL

R-in167A(10μM)             0.8μl

dH₂O(灭菌蒸馏水)            15.1μL

Taq(5U/μL)                 0.2μL

DNA模板                     2.0μL

                                  

总体积                      25μL

扩增条件：

预变性：94℃    5min

          ↓

变性：94℃      15s

退火：66℃      30s

延伸：72℃      30s

35个循环

          ↓

延伸：72℃      5min

(2)氨基酸198位扩增：

反应体系：

PCR buffer(10×)        2.5μL

dNTP(2.5mM each)            2μL

MgCl₂(25mM)                 1.5μL

F-out198/R-out198(10μM)    各0.4μl

F-in198A(10μM)             0.15μL

R-in198G(10μM)             0.4μl

dH₂O(灭菌蒸馏水)            15.45μL

Taq(5U/μL)                 0.2μL

DNA模板                     2.0μL

                                 

总体积                      25μL

扩增条件：

预变性：94℃    5min

           ↓

变性：94℃      15s

退火：65℃      30s

延伸：72℃      30s

35个循环

          ↓

延伸：72℃     5min

(3)氨基酸200位扩增：

反应体系：

PCR buffer(10×)           2.5μL

dNTP(2.5mM each)           2μL

MgCl₂(25mM)                1.5μL

F-out200/R-out200(10μM)   各0.8μl

F-in200T(10μM)            0.5μL

R-in200A(10μM)            0.5μl

dH₂O(灭菌蒸馏水)           14.2μL

Taq(5U/μL)                0.2μL

DNA模板                    2.0μL

                                     

总体积                     25μL

扩增条件：

预变性：94℃    5min

          ↓

变性：94℃      15s

退火：55℃    30s

延伸：72℃    30s

35个循环

        ↓

延伸：72℃    5min

第三步：将获得的PCR产物电泳，根据电泳图谱可以准确鉴定菌株基因型，并以此判断菌株抗药性水平。

2.根据权利要求1，禾谷镰孢菌群体中多菌灵抗性菌株基因型的分子检测和SNP分型方法其特征在于：用于Tetra-primer ARMS PCR技术检测的引物具有特异性，该引物特异性识别β₂-微管蛋白第167位、第198位、第200位密码子发生的点突变：

①扩增禾谷镰孢菌β₂-微管蛋白基因片断167位特异性引物对：

F-out167    5′GACCACCTTCAGGGTTTCCAGCTGACGC 3′

R-out167    5′GATCGGCGTACGAAGGATCGGCGATCTT 3′

F-in167T    5′GTTCCCCGATCGCATGATGGCCACTTT 3′

R-in167A    5′GAAACCTTGGGCGAGGGCATAACGGGAT 3′

②扩增禾谷镰孢菌β₂-微管蛋白基因片断198位特异性引物对：

F-out198    5′AGCTCGTTGAGGAAGCCATTGATGTT 3′

R-out198    5′CATGTTAACAGCGAGCTTTCGCAGAT 3′

F-in198A    5′GAACCAGCTCGTCGAGAACTCTGCCA 3′

R-in198G    5′GAGCCTCGTTATCGATACAGAAGGTATC 3′

③扩增禾谷镰孢菌β₂-微管蛋白基因片断200位特异性引物对：

F-out200    5′ACAACTGGGCCAAGGGTCATTACACC 3′

R-out200    5′AAGTCGGGGGAACGGAATCATGTTAAC 3′

F-in200T    5′CCAGCTCGTCGAGAACTCTGACGAGACTTT 3′

R-in200A    5′TCGTACAGAGCCTCGTTATCGATACGGT 3′