[发明专利]禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性基因型的分型检测方法

说明书

一、技术领域

本发明属于一种禾谷镰孢菌多菌灵抗性菌株基因型的分子检测和SNP分型方法，可用于苯并咪唑类杀菌剂(多菌灵)抗性禾谷镰孢菌的诊断和抗药性病原群体发展动态监测，进行不同抗药性水平的小麦赤霉病流行预测；并且能够进行SNP分型，为抗药性治理提供分子水平的理论依据。

二、技术背景

小麦赤霉病是由禾谷镰孢菌Fusarium graminearum Schwabe引起的一种世界性病害，严重影响小麦的产量和品质。长期以来采用苯并咪唑类杀菌剂或以这类药剂为主的复配剂进行化学防治。苯并咪唑类杀菌剂作为一类高效、广谱内吸性杀菌剂在生产上应用，解决了保护性杀菌剂的环境毒性问题，提高了人类控制该病害的能力。苯并咪唑类杀菌剂包括多菌灵、苯菌灵、噻菌灵、硫菌灵等。这些杀菌剂具有相同的抗菌谱和抗菌机制，他们也具有相同的抗药性机制，相互之间存在正交互抗药性。由于这类药剂的高度专化性，作用位点单一，加上施用频率高，使用多年后许多植物病原真菌群体中就会出现抗药性优势生理小种，使药剂防治完全失去效果。经过近几年的努力，南京农业大学杀菌剂实验室研究发现小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性菌株主要是由于禾谷镰孢菌β2-微管蛋白基因(FGSG_06611.3)突变造成，该基因编码第167位、198位、200位氨基酸密码子的突变均可引起该菌对多菌灵抗性的产生。已知编码167位氨基酸密码子突变是病原菌产生田间抗药性的主要原因，占所有突变类型总量的97％以上，表现中等水平抗药性；编码198位氨基酸密码子突变约占抗药性基因型的0.5％左右，变现高水平抗药性；编码200位氨基酸密码子突变的抗药性水平与167位突变类似。

发明人已经研究证明因病原菌在自然界的数量巨大，在禾谷镰孢菌群体中抗药性个体的比例达到3％～5％和适宜发病的环境条件下，即可发生抗药性小麦赤霉病流行，使药剂防治失败。传统的抗性检测方法是根据药剂不同剂量对菌丝生长的抑制效应来鉴别的，耗时长，测定抗药性水平的工作量更大，无法早期预测抗药性病害流行。本发明在抗药性机制研究的基础上，根据β2-微管蛋白基因点突变类型与抗药性水平的相关性，应用Tetra-primer ARMSPCR技术检测禾谷镰孢菌对多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂的抗药性。Tetra-primer ARMSPCR技术较等位基因特异性PCR更为准确，外引物作为阳性对照，内引物能特异地扩增不同基因型产物。因此，本发明具有的突出优点是：(1)准确性高。通过内外两对引物扩增DNA特异性片段，可以防止可能的假阳性。(2)能够诊断抗药性菌株的基因突变类型，判断抗药性水平，为抗性治理提供依据；(3)抗性检测耗时短，仅需6小时。

三、发明内容

技术问题本发明的目的在于提供一种禾谷镰孢菌多菌灵抗性菌株基因型的快速诊断和分子检测方法。本发明是在研究禾谷镰孢菌对多菌灵抗药性机制并已知存在三种基因点突变类型的基础上，首次研发的Tetra-primer ARMS PCR技术。根据抗药性菌株可能的基因突变机制，使用三组引物快速、准确地检测小麦赤霉病菌多菌灵抗性亚群体，检测准确率达到95％以上，对及时采取科学有效的措施控制当季抗药性病害流行，具有实用价值。

技术方案β2-微管蛋白基因(FGSG_06611.3)作为禾谷镰孢菌抗多菌灵的检测基因，其编码第167位、第198位、第200位氨基酸的密码子发生点突变作为分子检测的依据(表1)。

禾谷镰孢菌多菌灵抗性基因型的分型检测方法共分三步：

第一步：采用常规的苯酚·氯仿·异戊醇法，分别提取待测样品的核基因组DNA。

第二步：运用三组引物对，进行PCR反应，获得三组PCR产物。

用于Tetra-primer ARMS PCR技术检测的引物具有特异性，该引物对能对β₂-微管蛋白167位、198位、200位点突变进行特异性识别(表1)。

①扩增禾谷镰孢菌β₂-微管蛋白基因片断包含167位密码子的特异性引物对：

F-out167    5′GACCACCTTCAGGGTTTCCAGCTGACGC 3′

R-out167    5′GATCGGCGTACGAAGGATCGGCGATCTT 3′

F-in167T    5′GTTCCCCGATCGCATGATGGCCACTTT 3′

R-in167A    5′GAAACCTTGGGCGAGGGCATAACGGGAT 3′