[发明专利]海洋拟诺卡氏菌株HY-G及其产生的β-葡萄糖苷酶

权利要求书

1.一种海洋拟诺卡氏菌株HY-G(Nocardiopsis sp.HY-G)CCTCC NO：M 2010126。

2.一种如权利要求1所述的海洋拟诺卡氏菌株HY-G CCTCC NO：M2010126产β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于：其步骤如下：

(1)发酵：采用摇瓶发酵法，在250mL三角瓶中加入100mL液体发酵培养基，按照接种量为1％的比例接种海洋拟诺卡氏菌株HY-G的孢子悬液，孢子悬液的浓度为10⁶/mL；然后在23～38℃的培养温度下、在60～120转/分钟的摇床转速下培养72h，得发酵液；

(2)粗酶液的制备：取上述发酵液在8000转/分钟下离心10分钟，收获菌体；菌体用0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液洗涤2次并离心后，加入适量的上述Tris-HCl缓冲溶液重新悬浮菌体，在0℃冰浴的条件下，用超声波细胞破碎仪破碎菌体细胞，得菌体破碎液；取菌体破碎液在12000转/分钟下离心20分钟除去菌体碎片，所得上清液即为粗酶液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的粗酶液采用以下方法进行分离纯化：

(1)取粗酶液，加入硫酸铵至40％饱和度，离心去除沉淀得上清液；用1.7mol/L硫酸铵溶于0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液中制成平衡缓冲溶液，然后用平衡缓冲溶液平衡Phenyl-Sepharose柱，再用平衡过的Phenyl-Sepharose柱吸附上清液中的蛋白，用含0.34mol/L硫酸铵的0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液洗脱去除杂蛋白，再用0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液洗脱得到初步纯化的β-葡萄糖苷酶液；

(2)用0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液平衡DEAE-Sephrose柱，然后取初步纯化的β-葡萄糖苷酶液用DEAE-Sephrose柱吸附，通过梯度洗脱得到纯化的β-葡萄糖苷酶。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所得到的纯化的β-葡萄糖苷酶采用以下方法进一步纯化：先用0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液平衡Superdex 200HR凝胶色谱柱；然后对纯化的β-葡萄糖苷酶进行透析处理后用Superdex 200HR凝胶色谱柱吸附，再用0.01mol/L、pH 6.8的Tris-HCl缓冲溶液洗脱，收集A₂₈₀最大吸收峰并检测活性，活性组分即为进一步纯化的-葡萄糖苷酶。

5.一种如权利要求4所述的方法所述的β-葡萄糖苷酶，其特征在于：所产β-葡萄糖苷酶的酶学性质为：所述拟诺卡氏菌HY-G产生的β-葡萄糖苷酶属于胞内酶，其分子量为43～45kDa；该酶在以p-NPG为底物时，测得在pH 6.0-9.0有酶活力，其中在pH 7.0-8.0时酶活力强；该酶在40-60℃下具有有酶活性；Fe²⁺、Mg²⁺、Pb²⁺、Na⁺、Fe³⁺对该酶活性有促进作用，其中Fe²⁺、Fe³⁺促进作用强，Ca²⁺、Zn²⁺、Ag⁺、Cu²⁺、K⁺对该酶活性有抑制作用，其中Zn²⁺、Ag⁺、Cu²⁺抑制作用强。