[发明专利]琼脂平板筛选降解林可霉素好氧细菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及林可霉素降解菌的筛选，具体的说是一种以固体培养方式，在琼脂平板中筛选降解林可霉素好氧细菌的方法。

背景技术

抗生素生产废水、废渣有微量抗生素残留，具有长期残留性、生物蓄积性，易引起耐药性并存在各种安全隐患。微生物在治理环境污染中扮演着重要的角色，是抗生素在环境中降解的重要途径之一。微生物降解已广泛应用于抗生素废水的治理，但利用微生物治理抗生素废渣的研究较少，林可霉素生产废渣的降解菌研究更是尚未见报道。

从自然界中分离筛选微生物菌株，主要包括采样、纯种分离、筛选等几个步骤，通常纯种分离是在琼脂平板中进行，而筛选是在接种摇瓶进行。具体地说，琼脂平板的主要作用是分离微生物菌株，对微生物菌株进行定性，接种摇瓶的主要作用是对微生物菌株的生产性能或降解性能进行定量，从而筛选出最优菌株。

筛选出降解林可霉素的好氧细菌，其主要目的是用于降解废渣中林可霉素残留，在后期的应用中宜采用固体培养的方式，若采用液体培养的方式，存在设备投资大、耗水量大，产生二次污染等问题。基于降解林可霉素的好氧细菌在后期应用的考虑，降解林可霉素的好氧细菌筛选不宜在接种摇瓶中进行，而应在琼脂平板，通过固体培养的方式进行。

综上，本发明提供一种以固体培养方式，在琼脂平板中筛选降解林可霉素好氧细菌的方法，为实现利用微生物降解林可霉素生产废渣中的抗生素残留，开发废渣生产饲料、有机肥等奠定基础，为抗生素降解菌的筛选提供一定参考。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用固体培养方式，以琼脂平板筛选降解林可霉素好氧细菌的方法，具体步骤如下：

(1)基础培养基琼脂平板的制备：按下列浓度配制培养基，K₂HPO₄1.0g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，CaCl₂·2H₂O 0.04g/L，FeCl₃·6H₂O0.005g/L，NH₄NO₃ 0.25g/L，琼脂15～20g/L，于121℃灭菌15min，以10ml/个培养皿分装培养基，待培养基冷却凝固后在其表面均匀添加一定量的林可霉素水溶液，静置至表面干燥即可；

(2)琼脂中林可霉素测定方法：采用酸溶加热的方式溶解琼脂平板，通过紫外分光光度法测定林可霉素含量，对琼脂平板中林可霉素进行定量分析，为林可霉素降解菌的筛选奠定基础；

(3)样品采集：采集林可霉素生产废渣堆放处的土壤，利用无菌水配制成土壤稀释液用于菌种的分离；

(4)菌种分离：取0.2mL土壤稀释液涂布含0.015g林可霉素的基础培养基琼脂平板，30℃下培养5天，经稀释涂布分离单菌落，获得能够以林可霉素为唯一碳源和能源生长的菌株并保存试管中；

(5)菌种筛选：无菌水将分离得到的菌株配成菌悬液，OD值0.8，取0.2mL涂布含0.02g林可霉素的基础培养基琼脂平板中，以不接种的相同平板为空白对照，在30℃培养7天后，在优化得到的最佳酸溶解工艺条件下测定样品，并根据线性回归方程测定出琼脂平板中林可霉素的含量，以林可霉素降解率为指标，筛选林可霉素降解菌。

所述步骤(2)酸溶加热的条件为盐酸浓度1.14mol/L，加盐酸量3mL，加热时间70s。

所述步骤(2)测定琼脂平板中林可霉素的标准方程为y＝0.01533+0.00299x，其中x表示林可霉素浓度(ug/ml)，y表示吸光值，方程的相关系数r＝0.99935，浓度范围为0～250ug/mL，待测定的样品在静置30min后，该方法测定是稳定的，在30～120min内，RSD为0.13756％，精密度的RSD为0.2654％，重复性的RSD为0.4328％，样品回收率94.8858％。