[发明专利]一种建立迟发性皮肤卟啉病转基因小鼠模型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种建立迟发性皮肤卟啉病转基因小鼠模型的方法。

背景技术

迟发性皮肤卟啉病(porphyria cutanea tarda，PCT)是由于血红素生物合成过程中的第5个酶——尿卟啉原脱羧酶(uroporphyrinogen decarboxylase，URO-D)分子缺陷或活性降低而引发的一种最常见的卟啉病，多在中年以后发病，男性较多。有关PCT的研究最早见于1950年，在土耳其，人们因食用了喷洒过杀真菌剂六氯苯的小麦种子而引发了一场PCT的大爆发。从此以后人们用六氯苯等氯化的碳氢化合物诱发动物PCT。啮齿类动物摄入铁、血红素合成前体δ-氨基-γ-酮戊酸、酒精等也可诱发PCT。另一类用于研究PCT的动物模型就是URO-D基因敲除小鼠。但是，尚未有血红素氧化酶-1(Heme Oxygenase-1，HO-1)诱发人或动物PCT的研究报道。血红素氧化酶(heme oxygenase，HO)催化血红素分解产生铁，一氧化碳和胆绿素。申请者在制作了全身性过表达HO-1的转基因C57BL/6/DBA2(BDF1)小鼠后，发现该转基因雄性小鼠患上了迟发性皮肤卟啉病。该迟发性皮肤卟啉病动物模型基于HO-1转基因的过表达。

发明内容

本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：

一种建立迟发性皮肤卟啉病转基因小鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，构建一线性转基因序列，该序列从5′至3′依次含有chicken β -actin启动子，CMV增强子，小鼠HO-1 cDNA编码序列，终止信号rabbitβ-globin poly(A)序列；

步骤2，应用显微注射方法将构建的基因序列注入C57BL/6/DBA2(BDF1)小鼠受精卵；

步骤3，将步骤2中的受精卵植入假孕鼠的输卵管；

步骤4，产生F0代转基因小鼠，该小鼠基因组中整合有外源性HO-1表达序列；

步骤5，将获得的阳性转基因小鼠与野生型BDF1小鼠杂交，获得子代。

在上述的一种建立迟发性皮肤卟啉病转基因小鼠模型的方法，所述的构建一线性转基因序列的具体方位为：在小鼠基因组中扩增HO-1基因序列，克隆入pCAGG载体。HO-1 cDNA由chicken β-actin启动子和CMV增强子启动，HO-1连接rabbit β-globin poly(A)终止信号，质粒经SalI andDraI酶切，获得线性转基因序列。

因此，本发明具有如下优点：通过转基因技术过表达HO-1，建立了一种能自发再现迟发性皮肤卟啉病症状的小鼠模型，不仅为PCT的病因、发病机制作了理论上的补充，更为其治疗提供更多有价值的新理念。另一方面，本发明也为证明HO-1过表达还具有致病性提供证据，为今后利用HO-1保护机体提供理论及实验依据。

附图说明

附图1是显微注射用转基因构件示意图；

附图2是HO-1在转基因(Tg)及野生型(WT)小鼠肝脏中的表达及HO活性测定，A为Western blot检测HO-1在Tg及WT小鼠肝脏中的表达水平示意图；B为HO活性示意图，*，与同窝野生型小鼠比较p＜0.05；

附图3是雄性HO-1转基因(Tg)小鼠患PCT。其中，A和B为雄性HO-1Tg小鼠的牙齿受到紫外线照射时发出红色荧光(箭头所示)；C为牙齿发出红色荧光(红牙小鼠)及野生型小鼠的尿卟啉图。URO，uroporphyrin；HEPTA，hepatacarboxyporphyrin；COPRO，coproporphyrin；D和E为红牙小鼠的肝脏中PCT所特有的针样内容物(箭头所示)，×400。。

具体实施方式

下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

实施例：

结合附图，以下实施例仅用于说明本发明而不限制本发明的范围。

一、获得目的基因：

设计引物，在小鼠基因组中扩增HO-1基因序列，克隆入pCAGG载体。HO-1 cDNA由chicken β-actin启动子和CMV增强子启动，HO-1连接rabbit β-globin poly(A)终止信号(图1)。质粒经SalI and DraI酶切，获得线性转基因序列，纯化回收用于显微注射。

二、HO-1经显微注射引入BDF-1小鼠受精卵及阳性鼠的产生