[发明专利]骨螺科线粒体16S rRNA基因扩增引物的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种贝类线粒体16S rRNA[6S核糖体RNA(16 small-subunit ribosomal RNA)]基因扩增引物的筛选方法，特别是涉及一种骨螺科线粒体16S rRNA基因扩增引物的筛选方法。 

背景技术

骨螺科(Muricidae)隶属于腹足纲(Gastropoda)，前鳃亚纲(Prosobranchia)，新腹足目(Neogastropoda)，在世界各地的海域均有分布，其种类繁多，为新腹足目第二大科。骨螺科物种在维持海洋潮间带生态平衡具有重要作用，部分物种还可以作为检测海洋有毒污染物tributyltin(TBT)的指示工具。红螺属(Rapana)和荔枝螺属(Thais)的一些物种肉食鲜美，具有重要的经济价值。然而由于骨螺科的贝壳外部形态和齿舌结构的高度可变性，利用形态特征对骨螺科进行物种分类和系统发育的分析变得异常困难，特别对于一些亲缘物种，单利用形态特征很难区分开来。 

近年来，利用分子技术对物种进行分类和系统发育分析已成为一种有效的方法，其中线粒体16S rRNA基因已成为区分物种和研究物种进化关系的理想基因，并对许多物种得到了成功的应用。因此，利用16SrRNA基因对骨螺科进行物种鉴定和系统发育分析是一种很好的方法。 

尽管骨螺科物种16S rRNA序列比较保守，但种间变异度较大，使得16S rRNA非特异性扩增引物的扩增效率低下，有些物种根本无法扩出，以致阻碍了分子技术的使用。因此，骨螺科线粒体16S rRNA基因扩增引物的筛选，对利用分子方法鉴定骨螺科物种和进行系统发育分析具有重要的意义，同时也能为利用16S rRNA基因研究骨螺系统地理学和保护骨螺科种质资源提供技术条件。 

发明内容

本发明的目的是提供一种骨螺科线粒体16S rRNA基因扩增引物的筛选方法，它能满足现有技术的上述需求。 

一种骨螺科线粒体16S rRNA基因扩增引物的筛选方法，其特征是a、利用16S rRNA通用扩增引物16S rRNAar：5’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’和16S rRNAbr：5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’扩增出部分骨螺科物种的16S rRNA序列；b、从上述得到的部分骨螺科16S rRNA序列中，通过比对找出比较保守的序列片段，合成多套扩增引物序列；c、从合成的多套扩增引物序列中筛选出扩增骨螺科线粒体16S rRNA基因效果最好的一对引物16S rRNAarM：5’-GCGGTACTCTGACCGTGCAA-3’和16S rRNAbrM：5’-TCACGTAGAATTTTAATGGTCG-3’。 

本发明根据骨螺科物种16S rRNA序列变异度较高和非特异性扩增引物扩增效率低的特性，通过重复试验筛选出骨螺科16S rRNA基因的扩增引物。采用本发明的骨螺科线粒体16S rRNA基因扩增引物，可以有效的扩增出骨螺科不同物种的16S rRNA序列，对于利用16S rRNA序列研究骨螺科的物种分类、系统发育、系统地理学和保护骨螺科种质资源具有重要意义。 

具体实施方式

本发明的骨螺科线粒体16S rRNA基因扩增引物的筛选方法采用三个步骤：a、利用16S rRNA通用扩增引物扩增出部分骨螺科物种的16S rRNA序列；b、从上述得到的部分骨螺科16S rRNA序列中，通过比对找出比较保守的序列片段，合成多套扩增引物序列；c、从合成的多套扩增引物序列中筛选出扩增骨螺科线粒体16S rRNA基因效果最好的一对引物。 

下面结合实施例对本发明作进一步说明： 

1.样品采集：于2005年～2010年，从中国南北沿海共采集骨螺科10个属25个种类的160个个体。 

2.DNA提取：用CTAB法对所采集样品进行DNA提取。 

3.16S rRNA通用扩增引物扩增：利用Palumbi于1996年设计的16S rRNA通用扩增引物16S rRNAar(5’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’)、16S rRNAbr(5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’)对上述采集的骨螺科160个个体进行PCR扩增。不同物种的PCR热循环退火温度不同，退火温度范围为45℃～51℃。扩增产物经1.5倍的琼脂糖电泳检测后，送往测序公司进行双向测序。用Lasergene软件将测得的序列进行人工矫正。最终获得15个种类60个个体的16S rRNA序列，其长度约为560bp，其余个体均未扩增出。