[发明专利]甲型流感病毒耐药位点检测试剂盒及其制备与使用

权利要求书

1.一种甲型流感病毒耐药位点检测试剂盒，包括RT-PCR酶、阳性对照、阴性对照、引物、探针、RT-PCR MIX及水。

2.如权利要求1所述甲型流感病毒耐药位点检测试剂盒，其特征在于，所述各组分分别独立包装；或者也可以将引物、探针、RT-PCR MIX及水先混合配制IFVA-H274Y荧光PCR检测混合液后包装，再将其余组分分别独立包装。

3.如权利要求1所述甲型流感病毒耐药位点检测试剂盒，其特征在于，所述甲型流感病毒耐药位点为神经氨酸酶NA基因H274Y突变位点。

4.如权利要求1所述甲型流感病毒耐药位点检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为基因工程构建的含神经氨酸酶NA基因H274Y突变的质粒稀释品，所述阴性对照为DEPC-H₂O。

5.如权利要求4所述甲型流感病毒耐药位点检测试剂盒，其特征在于，所述质粒中含有序列与所述试剂盒中的引物对应H274Y突变NA基因的扩增片段序列相同的多核苷酸。

6.如权利要求1所述甲型流感病毒耐药位点检测试剂盒，其特征在于，所述引物包括IFVA上游引物与IFVA下游引物，所述IFVA上游引物在对应NA基因第601-822位区域中任意设计，所述IFVA下游引物在对应NA基因第826-1050位区域中任意设计，所述探针包含对应NA基因H274Y突变位点的碱基序列或其互补序列，在满足上述条件的基础上在对应H274Y突变NA基因中所设引物的扩增片段所对应的区域内任意设计。

7.如权利要求6所述甲型流感病毒耐药位点检测试剂盒，其特征在于，所述探针对应NA基因第800-850位区域中的片段。

8.如权利要求1所述甲型流感病毒耐药位点检测试剂盒，其特征在于，所述引物包括IFVA上游引物和IFVA下游引物，IFVA上游引物的序列为：tggacaggcctcatacaaga，IFVA下游引物的序列为：attcgagccatgccagttat，所述探针的序列为：cctcatagtaataa，所述探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团。

9.如权利要求2所述甲型流感病毒耐药位点检测试剂盒，其特征在于，所述IFVA-H274Y荧光PCR检测混合液中各组分的体积份数为：

上游引物    0.75

下游引物    0.75

探针        0.05

RT-PCR MIX  12.5

水          4.95。

10.如权利要求1-9任一所述甲型流感病毒耐药位点检测试剂盒的制备方法，选自以下任一：

方法一：

1)将引物、探针、RT-PCR MIX及水按配比混匀制备IFVA-H274Y荧光PCR检测混合液；

2)将IFVA-H274Y荧光PCR检测混合液、RT-PCR酶、阳性对照品和阴性对照品分别独包装并装配试剂盒；

方法二：

将引物、探针、RT-PCR MIX、水、RT-PCR酶、阳性对照品和阴性对照品分别独立包装后装配试剂盒。

11.如权利要求1-9任一所述甲型流感病毒耐药位点检测试剂盒的使用方法，包括下列步骤：

1)待测样本提取RNA获得待测样本RNA提取液；

2)选自以下任一：

分别将待测样本RNA提取液、阳性对照品及阴性对照品与IFVA-H274Y荧光PCR检测混合液及RT-PCR酶混合并进行PCR扩增反应，获得待测样本、阳性对照品及阴性对照品的Ct值以供分析；

分别将待测样本RNA提取液、阳性对照品及阴性对照品与引物、探针、RT-PCR MIX、水及RT-PCR酶混合并进行PCR扩增反应，获得待测样本、阳性对照品及阴性对照品的Ct值以供分析。