[发明专利]甲型流感病毒耐药位点检测试剂盒及其制备与使用

说明书

技术领域

本发明涉及一种甲型流感病毒耐药位点检测试剂盒及其制备方法与使用。

背景技术

甲型流感病毒为常见流感病毒，根据H和N抗原不同，甲型流感病毒又分为许多亚型，H可分为15个亚型(H1～H15)，N有9个亚型(N1～N9)。甲型流感病毒最容易发生变异，流感大流行就是甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起的。流感的特点是经常性的，不可预测的局部流行和罕见的全球大流行。1889年以来已出现几次由甲型流感病毒抗原变异导致的世界性大流行。流感流行伴随着死亡率的增加。在美国1972-1995年的流感流行研究中，23年中有19年发生流感流行并造成超额死亡。在11次不同的流感流行中，估计每次都有2万例与流感有关的死亡，其中6次超过4万例。

达菲(Tamiflu)，其通用名称为磷酸奥司他韦(Oseltamivir phosphate)，是罗氏制药独家生产的抗流感药物。奥司他韦(Oseltamivir)于1999年在瑞士上市，2001年10月在我国上市。达菲是一种非常有效的流感治疗用药，并且可以大大减少并发症(主要是气管与支气管炎、肺炎、咽炎等)的发生和抗生素的使用，因而是目前治疗流感的最常用药物之一，也是公认的抗禽流感病毒H5N1、甲型H1N1病毒最有效的药物之一。目前已有很多国家在大规模的囤积达菲，用来应对人群中流感的威胁。然而，随着达菲在治疗人感染甲型流感病毒中的广泛使用，出现了很多对达菲耐药的现象，甚至出现了对达菲呈抗药性的甲流死亡病例。从香港2008年1月到6月的监控数据看，在697例检测样本中有87例(占12.5％)样本检测为奥司他韦(达菲)耐药性。这87例样本都带有神经氨酸酶NA基因H274Y突变。

因此在使用达菲治疗前或治疗后，对甲型流感病毒进行耐药位点(H274Y)检测，对于指导临床用药和判定有非常重要的意义。目前检测基因位点突变的金标准是基因测序，该方法需要昂贵的检测设备，且操作周期较长，一般需要2-3天才能出结果，不便于国内大多数医院的开展和推广。近年来，以荧光定量PCR为代表的基因扩增技术迅速发展，它具有快速、特异性、灵敏度高、成本相对低等优点，被广泛应用于临床检测的各个方面。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测甲型流感病毒进行耐药位点(H274Y)的试剂盒及其制备方法及使用方法。

本发明的技术方案：

一种甲型流感病毒耐药位点检测试剂盒，包括RT-PCR酶、阳性对照及阴性对照、引物、探针、RT-PCR MIX及水。

试剂盒中，所述各组分分别独立包装；或者也可以将引物、探针、RT-PCR MIX及水先混合配制IFVA(Influenza viruses A)-H274Y荧光PCR检测混合液后包装，再将其余组分分别独立包装。为了试验方便，优选第二种方式。

所述甲型流感病毒耐药位点为神经氨酸酶NA基因H274Y突变位点。

所述RT-PCR MIX为dNTP、PCR buffer和MgCl₂的混合物，为成熟商品，可经市场途径购得。

所述阳性对照品可以为基因工程构建的含神经氨酸酶NA基因H274Y突变的质粒稀释品。所述阳性对照中质粒的浓度为1×10³copies/ml-1×10⁷copies/ml。

所述质粒中含有序列与IFVA-H274Y荧光PCR检测混合液中引物对应H274Y突变NA基因的扩增片段序列相同的多核苷酸。所述质粒可以为本领域熟知的细菌质粒或酵母质粒。

本发明所指H274Y突变NA基因是指发生了H274Y突变的神经氨酸酶NA对应的完整基因。

所述阴性对照可以为DEPC-H₂O。DEPC-H₂O即为DEPC处理水，是用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压消毒的纯水，不含RNase、DNase和proteinase。可以用于RNA沉淀的溶解，含有RNA的各种反应体系如反转录、siRNA的退火等，以及其它各种要求无RNase、DNase和proteinase的反应体系。DEPC处理水的制备为已知技术。