[发明专利]一种表达faeG的基因工程益生菌的构建方法及用途

说明书

技术领域

本发明属于畜牧兽医技术领域，尤其涉及一种表达产肠毒素性大肠杆菌粘附素基因faeG的基因工程益生菌构建及其在预防仔猪大肠杆菌性腹泻中的应用。

背景技术

由产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)引起的仔猪腹泻，对养猪生产构成严重威胁，养猪业每年因此而遭受巨大的经济损失。仔猪大肠杆菌性腹泻包括哺乳仔猪腹泻和断奶仔猪腹泻。哺乳仔猪大肠杆菌性腹泻又分为仔猪黄痢和白痢。仔猪黄痢是初生仔猪常发的急性、致死性传染病，主要发生于7日龄以内的乳猪，1～3日龄的乳猪多发，发病后以排黄色或黄白色稀便为特征。猪群一旦发病，很快传播开来，一窝仔猪中的发病率可达50％～100％，死亡率有的可达100％。仔猪白痢多发于10～30日龄的哺乳仔猪，以排灰白色有腥臭味的浆糊样稀便，严重的可排水样稀便为特征。仔猪断奶后大肠杆菌性腹泻多发生于断奶后1周，症状虽不像出生时那么明显，但常减慢仔猪增重速度，其它因素如断奶应激、食物的改变等都会加重病情。

当仔猪感染ETEC后，ETEC菌毛与小肠粘膜上皮的特异性受体结合，使得ETEC在小肠内定居，大量繁殖，产生耐热肠毒素(heat-stable enterotoxin，ST)或/和不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin，LT)。肠毒素侵入小肠上皮细胞内，改变上皮细胞的正常吸收和分泌，扰乱小肠代谢，使水、电解质大量进入小肠腔，从而引起剧烈腹泻。在这个过程中，菌毛和肠毒素被认为是主要的毒力因素，其中菌毛与小肠上皮结合是感染的首要步骤，也是致病的关键环节。不同ETEC菌株的菌毛抗原类型不同，主要有F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)和F41等，在我国最常见的是K88。

对于哺乳仔猪大肠杆菌性腹泻的预防，目前已有商业化疫苗可供选择，主要有F4(K88)-F5(K99)二价苗和大肠杆菌灭活苗。用这些疫苗免疫妊娠后期母猪，会在母猪体内产生特异性抗体，仔猪通过吮吸初乳获得母源抗体，从而阻止产肠毒素性大肠杆菌在肠内定居，避免疫病发生；但现有商业化疫苗对仔猪断奶后大肠杆菌性腹泻却难以奏效。此外，商业化的大肠杆菌灭活苗或大肠杆菌基因工程苗，因细菌胞壁含有脂多糖(内毒素)毒性成分，接种动物时会产生较强的副反应。

F4菌毛的生物合成和组装至少与FaeA-FaeJ 10个蛋白亚基有关。其中FaeG含量最多，系组成菌毛的主要亚基，与菌毛的粘附特性有关，是F4受体的主要结合位点。乳杆菌和乳球菌被视为公认安全(GRAS)的微生物，细胞壁不含脂多糖(内毒素)毒性成分，以其为受体菌构建表达产肠毒素性大肠杆菌粘附素基因faeG的基因工程益生菌，用于预防仔猪大肠杆菌性腹泻，具有广阔前景。目前国内在该领域的研究尚属空白。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种表达faeG(产肠毒素性大肠杆菌粘附素基因)的基因工程益生菌的构建方法及用途，本发明免疫原性好、具有佐剂效应、结构稳定、副作用小、制备简便。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种表达faeG的基因工程益生菌的构建方法，该方法包括以下步骤：

(1)获得大肠杆菌粘附素FaeG基因：以产肠毒素性大肠杆菌C83907质粒DNA为模板，设计合成含有Nco I和Xba I酶切位点的上下游引物P1和P2，上下游引物P1和P2分别具有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的基因序列。采用PCR方法扩增faeG目的基因片段。将扩增的faeG目的基因片段与pMD18-T载体连接，得重组质粒，转入大肠杆菌TOP10中，该重组质粒命名为pMD-faeG，其具有SEQ ID NO.1所示的基因序列。

(2)构建重组表达载体pNZ8148-faeG：将表达载体质粒pNZ8148和pMD-faeG用限制性内切酶Nco I和Xba I双酶切，纯化回收双酶切载体片段和目的片段。目的片段和双酶切载体片段连接后转化感受态E.coli MC1061，提取重组质粒，命名为pNZ8148-fae G，其具有SEQ ID NO.2所示的基因序列。

(3)构建表达大肠杆菌粘附素基因faeG的重组乳酸乳球菌：采用电转化方法将重组质粒pNZ8148-faeG转化感受态细胞L.lactis NZ9000，利用氯霉素对转化子进行筛选，得重组菌，命名为NZ9000/8148-faeG，其具有SEQ ID NO.3所示的基因序列。