[发明专利]乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段检测方法

权利要求书

1.一种乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段的检测方法，其特征在于，以乳酸杆菌整合膜蛋白DNA作为模板，加入7组不同引物进行RT-PCR反应，构建出IMP455~755、以及N-末端或C-末端缺失的6种突变蛋白IMP455~515， IMP455~635，IMP455~575，IMP635~755，IMP575~755和IMP515~755共7种PCR扩增产物；具体步骤如下：

步骤1，加入所述引物，将所述膜蛋白进行PCR扩增反应；所述引物与PCR扩增产物对应关系如下：

步骤2，对PCR扩增产物进行电泳分离，凝胶回收后得到所述6个突变DNA和IMP455-755；

步骤3，加入核酸内切酶、IMP455-755分别对6个突变DNA进行酶切；然后将酶切产物与载体BL21（DE3）按10：1比例，在连接酶的作用下分别进行连接；

步骤4，加热至65℃将连接产物灭活，用TOP10感受态细胞、无抗LB培养基以及涂有Amp抗性的平皿进行转化，得到转化产物；

步骤5，取所述转化产物，用Rosetta（DE3）XplyE、无抗LB培养基以及涂有Ch1、Amp抗性的平皿进一步培养；挑取菌落接种于TB培养基，IPTG进行诱导表达；离心分离后悬浮，95℃煮20分钟，然后进行SDS-PAGE电泳纯化；

步骤6，将上述表达产物进行SDS-PAGE电泳，然后以HRP标记的黏蛋白为直标一抗，进行WB和拷马斯亮蓝染检测，通过WB结果与拷马斯亮蓝染结果进行对比；在WB检测结果呈阳性反应的DNA片段中，找出与呈阴性反应DNA片段没有重复区域的DNA片段1，和完全包含呈阴性反应DNA片段的DNA片段2；所述DNA片段1和2的重复区域为所述整合膜蛋白活性片段，其中所述HRP标记粘蛋白方法如下：

取黏蛋白溶解于碳酸盐缓冲液，配置成黏蛋白溶液；配置HRP溶液：HRP溶于水中，加入过碘酸盐溶液，进行搅拌；然后于乙酸盐缓冲液中，透析；向所述透析产物中加入碳酸盐缓冲液，调节PH值至9.0～9.5，制备出HRP溶液；将所述黏蛋白溶液与所述HRP溶液混合，搅拌；向步骤3所得混合溶液中加入硼氢化钠，然后置于硼酸缓冲溶液中透析；制备出HRP标记的黏蛋白。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述RT-PCR扩增反应体系包括：10X缓冲溶液，dNTP，引物，DNA模板，rTag聚合酶和重蒸水。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述酶切过程中，反应体系包括：醋酸盐缓冲溶液，插入DNA目的片段，BSA和两种内切酶。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述两种内切酶为XhoⅠ和HindⅢ。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述连接过程中，反应体系包括：载体，所插入的DNA片段，DNA连接酶及其10X缓冲溶液。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述乙酸盐缓冲溶液PH值为4.4。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述透析均在4℃下进行。