[发明专利]乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种整合膜蛋白活性片段的检测方法，尤其涉及一种乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段的检测方法。

背景技术

益生菌是指改善宿主微生态平衡而发挥有益作用，达到提高宿主健康水平和健康状态的活菌制剂及其代谢产物，其广泛存在于地球上的各个角落，是一种对人和动物有益的细菌，它们可直接作为食品添加剂服用，以维持肠道菌丛的平衡，在肠道内的黏附和定植能抑制致病菌的损伤，对于保护肠道黏膜的完整性具有重要的意义；自90年代初以来，形形色色的“益生菌”类保健品风靡了整个世界，与此同时，“益生菌”的研究业已成为国际上的热门研究课题。

乳酸杆菌是益生菌中及其重要的一种，可以与靶细胞黏附，竞争抑制致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）和侵袭性大肠杆菌（EIEC）等致病菌对人体肠道屏障功能的损害；激发继发于黏附的细胞内信号转导途径，降低肠上皮细胞（IEC）的通透性；调节人体肠道黏膜免疫功能，促进树突状细胞（DC）分化成熟，以及诱导肠道T细胞分化成熟等。

近几年来研究表明，乳酸杆菌的表面蛋白（surface layer protein，SLP）在乳酸杆菌益生作用中起着核心作用。有学者将SLP进行分离和纯化，发现表面蛋白P40和P70与乳酸杆菌类似，能增加IEC紧密连接（TJ）蛋白的表达，维持TJ的完整性，进一步研究发现其调节机制可能与促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路有关。Bernet 等研究益生菌与体外培养Caco-2细胞的黏附，认为其黏附成分可能是细菌表面的不稳定蛋白质。Fujiwara等从益生菌液上清中分离出一种分子量为52kDa的蛋白质，此种物质能抑制EPEC对人肠道上皮细胞（HIEC）的黏附。Konstantinov等在研究嗜酸性乳酸杆菌与树突状细胞相互作用时，发现其SLP能调节IL-10和IL-12的合成与分泌（Proc Natl Acad Sci U.S.A. ，2008；105（49）：19474-79）。我们的前期研究（BMC Microbiol，2008；9：63）也发现经植物乳酸杆菌（LP）分离纯化的SLP具有生物学活性，能上调IEC表面TJ的表达，抑制EPEC对IEC的损伤作用，但其蛋白片段较大，结构域不清，作用机制尚不明，抗病能力较弱。

我们通过对乳酸杆菌SLP进行筛选，质谱分析，克隆表达和反复筛选验证，发现其表层黏附蛋白为整合膜蛋白（integral membrane protein，IMP，GI：28378881），并且黏附区域为与表层蛋白的中间片段IMP455-755（中华实验外科杂志，2009；26（5）：1626-1631）。

但是对于乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段的研究较少，而活性片段为具有黏附活性的微小片段（Micro Integral Membrane Protein，MIMP），其分子较小，具有较高的效价和特异性，应用价值较大；此外，因其特有的亲疏水性结构及其所发挥的生物学效应，可以弥补乳酸杆菌易位及不耐抗生素的缺陷，有着重要的临床应用价值。因此，对乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段的确认具有重要的应用价值。

发明内容

本发明提供了一种乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段（MIMP）的检测方法，通过构建N-末端或C-末端缺失的突变蛋白，得到6个突变蛋白；以HRP标记的黏蛋白为指标一抗，通过Western bolt（WB）检测结果与拷马斯亮蓝（Coomassiebrilliant Blue）染检测结果进行对比，进行确认MIMP。

本发明乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段（MIMP）检测方法，步骤如下：

步骤1，以乳酸杆菌整合膜蛋白DNA作为模板，加入引物进行RT-PCR反应，构建出7种PCR扩增产物；其中，所述PCR扩增产物包括：IMP455-755，以及N-末端或C-末端缺失的6种突变蛋白IMP455~515， IMP455~635，IMP455~575，IMP635~755，IMP575~755和IMP515~755；所述引物与PCR扩增产物对应关系如下：

步骤2，将上述PCR扩增产物进行SDS-PAGE电泳，然后以HRP标记的黏蛋白为直标一抗，进行WB和拷马斯亮蓝染检测，将WB结果与拷马斯亮蓝染结果进行对比；在WB检测结果呈阳性反应的DNA片段中，找出与呈阴性反应DNA片段没有重复区域的DNA片段1，和完全包含呈阴性反应DNA片段的DNA片段2；所述DNA片段1和2的重复区域为所述整合膜蛋白活性片段。

所述N-末端或C-末端缺失的突变蛋白构建方法如下：