[发明专利]碱性橙半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于食品安全技术领域。具体涉及碱性橙半抗原、人工抗原和抗体的制备方法及应用。 

背景技术

碱性橙，化学名为2，4-二胺基偶氮苯，俗名“王金黄“，是一种偶氮类碱性工业染料，用于腈纶、蚕丝、羊毛、二醋纤单宁媒纤维的染色，也可以用于皮革麻的染色和竹、木、纸张、蚊香的着色及制造色淀、溶剂染料、阳离子染料。 

碱性橙在体内代谢成胺类，有强致癌性。根据美国卫生研究所(NIH)化学品健康与安全数据库资料表明：摄取、吸入以及皮肤接触该物质均会造成急性和慢性的中毒伤害。根据《中华人民共和国食品添加剂使用卫生标准》(G B2760)及《中华人民共和国食品卫生法》的相关规定，该物质为禁止用作食品添加剂的化学制品。 

由于在中性及偏碱性条件下，碱性橙与蛋白质吸附较牢固，不易褪色，因此有些不法商人就将其用于豆制品的染色，使腐竹、豆皮的色泽光亮，欺骗消费者，使消费者的身体健康受到严重影响。对碱性橙残留的检测具有重要的意义。 

对碱性橙残留的检测目前主要要有薄层层析(TLC)、高效液相色谱/紫外检测器(HPLC/UVD)、高效液相色谱/光电二级管陈列(HPLC/PDA)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)、气相色谱-质谱联 用(GS-MS)等方法。这些仪器检测方法操作复杂、需受过专门训练的专业人员才能操作，而且存在着适用范围窄、设备昂贵、成本高等问题。目前我国相应的碱性橙检测技术不完备，很有必要研制更加简单快捷方便的检测方法和产品。 

免疫检测方法应用于碱性橙的检测相对简单快捷。免疫检测方法包括胶体金免疫层析法、ELISA法，是目前食品安全快速检测的两种重要方法，已经在食品安全检测中发挥着越来越明显的作用。免疫检测方法都必须首先制备出碱性橙半抗原、抗原及抗体，然后才能利用这些试剂建立免疫检测方法。 

胥传来等公开了一种专利《一种碱性橙II完全抗原的合成方法》(申请号：200910031728.X)，以碱性橙II为半抗原，用重氮化法将其与载体蛋白BSA偶联制备抗体；赵志磊等公开了一种专利《碱性橙人工抗原合成及抗体制备方法》(申请号：200810079538.0)，以戊二醛为偶联剂分别与牛血清白蛋白。 

但是，碱性橙与很多偶氮类燃料很类似，其苯环上的氨基数目及位置是区别于其他染料的特征结构，在半抗原设计时若不保留特征结构，抗体的特异性将受到很大影响。 

因此，需要寻找新的方法，在半抗原设计时能保留碱性橙的特征结构，保证抗体的特异性才能获得理想的检测效果。 

发明内容

本发明的一个目的是填补碱性橙现有检测技术的不足，提供一种碱性橙人工半抗原、人工抗原和特异性抗体。 

本发明的另一个目的是提供所述碱性橙人工半抗原、人工抗原和特异性抗体的制备方法。 

本发明还有一个目的是提供所述碱性橙人工半抗原、人工抗原和特异性抗体的应用。 

本发明的目的通过以下技术方案予以实现： 

提供一种碱性橙人工半抗原、人工抗原和特异性抗体，所述碱性橙人工半抗原具有式(I)或式(II)所示结构： 

其中，式(I)或式(II)中n＝0～3。 

所述碱性橙人工抗原，具有式(III)或式(IV)所示结构： 

本发明提供了所述碱性橙半抗原的制备方法，以间苯二胺为原料，与对氨基苯酸或间氨基苯酸通过重氮化反应生成含羧基的半抗原。包括以下步骤： 

(1)将对氨基苯酸或间氨基苯酸1～3mmol溶于20ml水中，加入10ml0.1mol/l的盐酸，加入含114～228mg(1.15～3.3mmol)的亚硝酸钠水溶液1mL，反应2h，反应液为重氮液； 

(2)将1～3倍于对(间)氨基苯酸物质的量的间苯二胺溶于5mL水中，用1mol/L盐酸调节pH值至6～7，然后逐滴加入步骤(1)制备得到的重氮液，静置过夜，离心所得沉淀即为半抗原。 

本发明所述人工抗原的制备可采用活泼脂法或者混合酸酐法与蛋白质偶联制备人工抗原，也可以根据本发明设计思想，采用本领域其他常规方法将本发明所述半抗原与蛋白质偶联制备人工抗原。 

本发明所述抗原的制备方法包括以下步骤(活泼酯法)： 

(1)将权利要求1所述半抗原5～10mg溶解于1～3ml二氧六环或二甲基甲酰胺中，加入5～10mg二环己基碳二亚胺和5～10mgN-羟基琥珀酰亚胺，反应3.5～5h，离心除去沉淀得上清；