[发明专利]恩诺沙星半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于食品安全技术领域。具体涉及恩诺沙星半抗原、人工抗原和抗体的制备方法及应用。

背景技术

恩诺沙星(Enrofloxacin，EF)，其分子式为C₁₉H₂₂FN₃O₃，分子量为359.40，微黄色或淡橙黄色结晶性粉末，无臭，味微苦；遇光色渐变为橙红色，其结构式为式(1)所示：

恩诺沙星为第三代喹诺酮类(FQs)的典型代表之一，具有抗菌谱广、毒副作用小、血药浓度高、半衰期长、制剂形式多样、药效价格比高等特点，对各种革兰氏阴性和阳性菌均具有强大的抑菌作用，与青霉素、头孢菌素和氨基类药物均无交叉耐药性等特点，对于治疗炭疽热病症具有特效作用。

FQs药物因其能抑制细菌DNA螺旋酶、抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透力强，抗菌作用是磺胺类药的近千倍，加之系化学合成药物，价格低廉，故在医学和兽医学中很快取得广泛应用，尤其在水产养殖中成为最重要的抗感染药物之一。FQs药物对动物体以及人体的绝大部分器官和组织都有不同程度的不良反应：由于FQs药物呈脂溶性，可通过血脑屏障进入脑组织，抑制γ-氨基丁酸(GABA)与其受体结合而产生神经系统反应。故以神经系统的损伤最为常见，其次是皮肤及其附件的损伤。多数不良反应症状较轻，且可逆，但也有较重甚至危及生命的。动物实验表明，FQs药物可引起幼畜关节炎、跟键炎，也能引起过敏性休克，恶心、呕吐，静脉炎等症状以及某些潜在的致癌性质，同时由于致病菌产生耐药性，恩诺沙星药物的残留问题已引起广泛关注。美国和欧盟规定在禽食用组织中方的最高残留限量为恩诺沙星和恩诺沙星为30μg/Kg；我国农业部标准NY5070-2001《无公害食品水产品中渔药残留限量》规定恩诺沙星残留限量为50μg/Kg。

目前，对畜禽水产品中恩诺沙星残留的检测主要采用高效液相色谱法(HPLC)、气相等仪器检测方法。然而应用仪器方法时，其灵敏度受样品的净化、浓缩等步骤的影响很大，测定方法存在复杂、繁琐、检测通量小、需要专业人员和专业技能、检测成本昂贵等缺陷，不能实现大批量样品的快速检测分析。因此，有必要研制更加简单快捷方便的检测方法。

免疫检测方法，是目前食品安全快速检测的重要方法之一，检测成本很低，使用简单，适合大量样品的筛选检测，已经在食品安全检测中发挥了重要作用。人工抗原的合成是半抗原物质免疫分析方法建立的的关键，对于恩诺沙星，因为其本身含有羧基，不需要衍生，因此目前都是直接利用该羧基和蛋白质连接。譬如，蔡勤仁等发表了论文“恩诺沙星单克隆抗体的制备及鉴定”(中国农业科学，2004)，采用碳二亚胺法，直接偶联羧基和蛋白质的氨基合成了恩诺沙星人工抗原；唐宏等公开了一种专利“恩诺沙星单克隆抗体及应用(申请号200910027793.5)”，采用碳二亚胺法将恩诺沙星和载体蛋白BSA、HSA及OVA偶联。

但是，现有技术获得的恩诺沙星抗体的特异性和识别力不够。

发明内容

本发明的一个目的是填补恩诺沙星现有检测技术的不足，提供一种恩诺沙星人工半抗原、人工抗原和特异性单克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供所述恩诺沙星人工半抗原、人工抗原和特异性单克隆抗体的制备方法。

本发明还有一个目的是提供所述恩诺沙星人工半抗原、人工抗原和特异性单克隆抗体的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种恩诺沙星人工半抗原、人工抗原和特异性单克隆抗体，所述恩诺沙星人工半抗原具有式(II)所示分子结构：

其中，n为-CH₂基团数目，n＝4或6，优选n＝4。

所述恩诺沙星人工抗原，具有式(III)所示分子结构：

其中，n为-CH₂基团数目，n＝4或6，优选n＝4。

本发明提供了所述恩诺沙星半抗原的制备方法，是以恩诺沙星与氨基丁酸(H₂NCH₂CH₂CH₂COOH)或氨基己酸(H₂NCH₂(CH₂)₄COOH)在NHS、DDC和DMF存在条件下反应生成含4个或6个碳原子手臂的半抗原。

恩诺沙星半抗原合成路线(以生成结构式中n取值为4为例)：

本发明所述恩诺沙星半抗原的制备包括以下步骤：