[发明专利]一种诱导扇贝组织细胞体外转化的方法

权利要求书

1.一种诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，包括构建重组SV40LT以及报告基因GFP的慢病毒表达质粒，并利用293FT细胞包装出能够表达目的基因的重组泛嗜性慢病毒，其特征在于使用重组泛嗜性慢病毒感染扇贝体外培养组织细胞，并用浓度为2～7微克/毫升的灭瘟素筛选得到产生荧光或具有分裂能力的扇贝体外培养组织转化细胞。

2.如权利要求1所述的诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，其特征是所述的扇贝体外培养的组织细胞是栉孔扇贝体外培养心脏细胞。

3.如权利要求1所述的诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，其特征是所述的重组泛嗜性慢病毒感染扇贝体外培养组织细胞的感染方法是：将含1000～3000个重组泛嗜性慢病毒的病毒液加入1毫升的扇贝组织细胞培养基中，同时加入6微克/毫升聚凝胺，培养扇贝组织细胞12～16小时即完成诱导扇贝组织细胞体外转化。

4.如权利要求1所述的诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，其特征是所述的灭瘟素筛选方法：使用上述重组泛嗜性慢病毒感染扇贝体外培养组织细胞3～5天后，在2毫升扇贝组织细胞培养基中添加4～14微克灭瘟素对转化细胞进行培养，每3～4天重新添加上述含有灭瘟素的培养基，培养7～10天呈现被筛选出的转化细胞。

5.如权利要求2所述的诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，其特征是所述的栉孔扇贝体外培养心脏细胞的培养方法是：首先将栉孔扇贝心脏组织样品用煮沸的过滤海水清洗干净，在栉孔扇贝心脏组织专用消毒液中浸泡20分钟，煮沸的过滤海水清洗后移至栉孔扇贝心脏组织剪切液中，剪切至1立方毫米大小后均匀排布于含1.5毫升培养基的25毫升培养瓶中，再置于23℃的生化培养箱中培养16～24小时，之后每天替换2毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基，至栉孔扇贝心脏细胞迁出后即得到栉孔扇贝体外培养心脏细胞，每3天更换栉孔扇贝心脏细胞培养基一次，以维持体外培养心脏细胞正常生长。

6.根据权利要求5所述的诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，其特征是所述的栉孔扇贝心脏细胞培养基配制方法：首先在溶解了13.7克L15培养基粉末的1升水溶液中添加NaCl 20.2克、KCl 0.54克、CaCl₂0.60克、MgSO₄1克和MgCl₂3.9克，用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌；使用前再添加已过滤除菌的5％胎牛血清、6毫摩尔钙离子、2毫摩尔L谷氨酰胺、50毫摩尔牛磺酸、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素、50微克/毫升卡那霉素和1微克/毫升制霉菌素；最后调节pH值至7.2～7.4即制成。

7.根据权利要求5所述的诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，其特征是所述的栉孔扇贝心脏组织专用消毒液是含有500单位/毫升青霉素、500微克/毫升链霉素、100单位/毫升庆大霉素和2微克/毫升制霉菌素的煮沸的过滤海水的水溶液。

8.根据权利要求5所述的诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，其特征是所述的栉孔扇贝心脏组织剪切液为煮沸的过滤海水或含5％胎牛血清的L15基本培养基。