[发明专利]一种诱导扇贝组织细胞体外转化的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，即利用重组泛嗜性慢病毒介导外源基因整合到体外培养的栉孔扇贝细胞中。

背景技术

海洋双壳类具较高的经济价值，是我国海水养殖业的重要组成部分。建立海洋双壳类细胞的体外培养体系，将为其基础生物学、病原体侵染机制、新品种开发研究以及功能基因的分析等搭建平台，并最终为扇贝细胞系的建立构建基础。但在目前的研究中多涉及添加促进细胞分裂的营养因子，其研究过程漫长、工作量大且进展缓慢。

对比于其他组织，心脏组织由于心脏围心膜的存在，在体外培养时较易克服微生物的污染，但是心脏细胞属于终末分化细胞，退出了细胞分裂周期，导致体外培养时间有限，所以采用传统方法进行心脏细胞体外培养比较困难。工作量大且易发生污染。因此急需建立一种新的体外转化方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，以克服现有技术的不足。

本发明特别使用重组泛嗜性慢病毒感染扇贝体外培养心脏细胞，使已经退出细胞分裂周期的心脏细胞重获分裂增殖能力，表明该方法用在具有一定分裂能力的扇贝其他组织细胞中同样可以获得成功转化的细胞，具有通用性。

本发明的技术方案如下：构建重组SV40LT以及报告基因GFP的慢病毒表达质粒，并利用293FT细胞包装出能够表达目的基因的重组泛嗜性慢病毒；其特征在于使用重组泛嗜性慢病毒感染扇贝体外培养组织细胞，并用浓度为2～7微克/毫升的灭瘟素筛选得到产生荧光或具有分裂能力的转化细胞。

扇贝体外培养心脏细胞的培养方法是：首先将扇贝心脏组织样品，尤其是栉孔扇贝心脏组织用煮沸的过滤海水清洗干净，在栉孔扇贝心脏组织专用消毒液中浸泡20分钟，煮沸的过滤海水清洗后移至栉孔扇贝心脏组织剪切液中，剪切至1立方毫米大小后均匀排布于含1.5毫升培养基的25毫升培养瓶中，再置于23℃的生化培养箱中培养16～24小时，之后每天替换2毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基，至栉孔扇贝心脏细胞迁出后即得到栉孔扇贝体外培养心脏细胞，每3天换液一次栉孔扇贝心脏细胞培养基，以维持体外培养心脏细胞正常生长。

所述的栉孔扇贝心脏细胞培养基配制方法：首先在溶解了13.7克L15培养基粉末的1升水溶液中添加NaCl 20.2克、KCl 0.54克、CaCl₂0.60克、MgSO₄1克和MgCl₂3.9克，成为1100毫渗透摩尔的高渗透压的基本培养基，即使L15培养基粉末水溶液获得与煮沸的过滤海水相近的渗透压；用0.22微米的微孔滤膜过滤除菌；然后再添加已经过滤除菌的5％胎牛血清、6毫摩尔钙离子、2毫摩尔L谷氨酰胺、50毫摩尔牛磺酸、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素、50微克/毫升卡那霉素和1微克/毫升制霉菌素；最后调节pH值至7.2～7.4。

所述的栉孔扇贝心脏组织专用消毒液配方是含有500单位/毫升青霉素、500微克/毫升链霉素、100单位/毫升庆大霉素和2微克/毫升制霉菌素的煮沸的过滤海水的水溶液。

所述的栉孔扇贝心脏组织剪切液为煮沸的过滤海水或含5％胎牛血清的L15基本培养基。

所述的煮沸的过滤海水较已有的高压灭菌过滤海水及其制备方法更加简单、节省时间，且能很好的达到除去过滤海水中微生物的目的。

所述栉孔扇贝的组织细胞的重组泛嗜性慢病毒感染方法是将含1000～3000个重组泛嗜性慢病毒的病毒液加入1毫升的栉孔扇贝心脏细胞培养基中，之后培养栉孔扇贝心脏细胞12～16小时，同时加入6微克/毫升聚凝胺。

所述的灭瘟素筛选方法为，使用上述重组泛嗜性慢病毒感染扇贝体外培养组织细胞3～5天后，在2毫升扇贝组织细胞培养基中添加4～14微克灭瘟素对转化细胞进行培养，每3～4天重新添加上述含有灭瘟素的培养基，培养7～10天呈现被筛选出的转化细胞。

本发明利用重组泛嗜性慢病毒高效的将外源基因转移到栉孔扇贝体外培养心脏细胞中，将外源基因稳定的整合到栉孔扇贝心脏细胞基因组中，使该外源基因能够持续的表达，促进细胞增殖，为进一步构建栉孔扇贝细胞系奠定基础。

具体实施方式

本发明首先将重组SV40LT以及报告基因GFP的慢病毒表达质粒，与商品化的包装载体一同转染到293FT细胞中即产生重组泛嗜性慢病毒，收集含有重组泛嗜性慢病毒的293FT细胞培养液并低温保存。