[发明专利]一种极小类胚胎样干细胞的制备方法

权利要求书

1.一种极小类胚胎样干细胞的制备方法，其特征在于采用全骨髓培养法，以多次更换培养液的方式逐步去除未贴壁的细胞，细胞呈明显克隆样生长后，酶解使其重新悬浮，流式细胞仪富集sca-1(+)、lineage(-)及CD45(-)的亚群细胞，即得极小类胚胎样干细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于全骨髓培养法的培养时间为5-6天，更换培养液的次数为3次。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于全骨髓培养法的培养时间为5-6天，培养液的更换次数为3次，第1次为24小时，以后每隔两天清洗一次。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在该方法的具体步骤如下：

a.取出全骨髓细胞接种到塑料培养瓶中，置于37℃、含5％CO2的潮湿培养箱中培养；

b.接种后24小时初次更换培养液，去除非贴壁细胞，之后每两天更换一次培养液，共计更换3次；

c.全骨髓细胞培养5天，细胞呈明显克隆样生长后，加入0.25％胰酶-0.02％EDTA液使所有细胞重新悬浮；

d.将细胞悬液加至荧光素标记抗体稀释液混匀，避光，置冰上孵育30min；

e.清洗未结合的抗体，离心，重复两次，然后重新悬浮；

f.以流式细胞仪分选sca-1(+)/lin(-)/CD45(-)亚群细胞，即极小类胚胎样干细胞。