[发明专利]一种极小类胚胎样干细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种骨髓干细胞分选制备方法，具体的涉及极小类胚胎样干细胞的分选制备方法。

背景技术

心血管疾病每年夺走1200万人的生命，接近世界人口总死亡的1/4，成为人类健康的头号大敌。对于心肌梗死或心力衰竭，传统的治疗方法，包括药物、介入和外科手术均不能使缺失的心肌细胞再生，由于心肌缺失造成不可逆转的心肌重塑过程，终至心力衰竭和死亡。近年来，干细胞再生医学在心血管疾病治疗中取得了突破性进展，该技术又被称为细胞心肌成形术(cellular cardiomyoplasty)，即通过移植干细胞或心肌细胞，或者动员外周循环血干细胞或骨髓干细胞迁移到心肌受损部位来实现损伤心肌的修复。

目前应用于动物实验及临床实验的干细胞种类主要包括胚胎干细胞和各种成体干细胞。胚胎干细胞由于受到免疫排除和伦理道德等问题的干扰，因而在临床应用中受到限制。成体干细胞，主要包括造血干细胞、骨髓单核细胞、骨髓间充质干细胞、内皮祖细胞、骨骼肌成肌细胞、脐血干细胞及脂肪来源的干细胞等。成体骨髓干细胞不存在免疫排斥反应，采取方便，被认为是最有前景的细胞移植类型。

通常认为干细胞移植可以增加细胞因子如VEGF的释放，促进缺血区新生血管的形成，改善灌注、改善冬眠心肌和顿抑心肌的功能，减少心室扩张和心室重构。移植的干细胞在局部微环境的诱导下可以分化为心肌细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞等，即具有可塑性，但也有研究发现移植的骨髓干细胞并没有分化为心肌细胞，只是分化为不同的血液细胞。因此，目前争议的焦点主要是成体干细胞的横向分化潜能。

近年来，研究者在成体组织中发现类似于胚胎干细胞的、能真正横向分化的成体干细胞类型。

数项研究表明骨髓中存在表达多能干细胞标记(如Oct-4、Nanog、SSEA-1、Rex-1等)的成体干细胞，如MSC亚群[Colter DC，Sekiya I，ProckopDJ.Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotentialadult stem cells in colonies of human marrow stromal cells.Proc Natl Acad Sci US A，2001.(98)：7841-7845.Pochampally RR，Smith JR，Ylostalo J，et al.，Serum deprivation of human marrow stromal cells(hMSCs)selects for asubpopulation of early progenitor cells with enhanced expression of OCT-4 andother embryonic genes.Blood，2004.103：1647-1652]、MAPC[Jiang Y，Jahagirdar BN，Reinhardt RL，et al.，Pluripotency of mesenchymal stem cellsderived from adult marrow.Nature，2002.418：41-49]、MIAMI[D’Ippolito G，Diabira S，Howard GA，et al.，Marrow-isolated adult multilineage inducible(MIAMI)cells，a unique population of postnatal young and old human cells withextensive expansion and differentiation potential.J Cell Sci，2004.117：2971-2981]、USSC[Kogler G，Sensken S，Airey JA，et al.，A new human somatic stemcell from placental cord blood with intrinsic pluripotent differentiation potential.J Exp Med，2004.200：123-135]等。2004年，Kucia等[Kucia，M.，et al.，Cellsexpressing early cardiac markers reside in the bone marrow and are mobilizedinto the peripheral blood after myocardial infarction.Circ Res，2004.95(12)：1191-9]首次报道小鼠骨髓MNCs中富集一类表达心肌细胞转录因子(Nkx2.5/Csx，GATA-4，MEF2C)的非造血干细胞，表面标记为CXCR4(+)、lin(-)、CD45(-)、Sca-1(-)。该研究小组连续进行数项研究，于2006年首次提出极小类胚胎样干细胞(very small embryonic-like stem cells，VSELs)的概念[Kucia M.，et al.，A population of very small embryonic-like(VSEL)CXCR4(+)SSEA-1(+)Oct-4+stem cells identified in adult bone marrow.Leukemia，2006.20(5)：857-69]。