[发明专利]一种检测羊多头蚴的酶联免疫试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及有蹄动物的脑和脊髓内寄生虫病免疫抗体检测技术领域，尤其涉及针对羊感染多头蚴的诊断及其检测需要的一种酶联免疫试剂盒。

背景技术

脑多头蚴病(Coenuriasis)又叫脑包虫病，是由带科的多头带绦虫(Taeniamulticeps)的中绦期幼虫——脑多头蚴(Coenurus cerebralis)寄生于绵羊、山羊、黄牛、牦牛和骆驼等有蹄动物的脑和脊髓等处引起的一种寄生虫病，也偶见有人感染此病的报道；其成虫寄生于犬、豺、狼和狐狸等的小肠内。本病多发于6～18个月龄的绵羊，病程缓慢，患病动物多以死亡为转归，给畜牧业造成巨大的经济损失。

近年来，血清学诊断技术被应用于脑多头蚴病的诊断，但由于所用的诊断抗原主要是多头蚴原头节抗原和囊液抗原等虫体天然抗原，它们来源十分有限，不能满足实际的需要。

随着分子生物学技术的发展及其在寄生虫学的应用，带科绦虫基因重组抗原已经成为研究的焦点而且取得了突破性进展，各国学者对用于绦虫蚴病诊断的候选基因作了大量研究工作。在诊断中，大分子蛋白在不同绦虫间易产生交叉反应，特异性低，因而目前侧重于低分子量诊断抗原的研究。在猪囊虫病的诊断方面，成功克隆表达了糖蛋白抗原(LLGP)中的GP50、Ts14和T24蛋白，8kDa的Ts8B1和Ts8B2以及10kDa蛋白；细粒棘球蚴病上也成功克隆表达出了AgB2、EpC1、硫氧还蛋白过氧化物酶(EgTPx)p29等小分子量蛋白。以上抗原用于诊断，均有较好的敏感性和特异性。

本研究借鉴猪囊尾蚴病和细粒棘球蚴病诊断抗原成功克隆表达的经验，通过分子生物学的方法，人工合成一种可以用于脑多头蚴病诊断的重组抗原，并构建一种简单、快速的脑多头蚴病诊断方法及其所需的酶联免疫试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测羊多头蚴的酶联免疫试剂盒，可快速有效的检测羊多头蚴感染的抗体水平，从分子生物学的角度，为预防、诊断脑包虫病奠定基础。

实现本发明之目的技术解决方案如下：

一种检测羊多头蚴的酶联免疫试剂盒，包括试剂盒1内包被着包被原的诊断膜片1.1，酶标记物1.2，阴性对照血清1.3，阳性对照血清1.4，底物溶液1.5，洗涤液1.6，其特征是，所述包被原是羊多头蚴基因重组抗原蛋白，所述酶标记物是酶标抗抗体。

所述的检测羊多头蚴的基因重组抗原蛋白，其氨基酸序列为序列表SEQ ID NO：1所示序列。

所述的检测羊多头蚴的基因重组抗原蛋白的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO：2所示序列。

所述的检测羊多头蚴的基因重组抗原蛋白的重组体是pET-32a-Tm7重组表达质粒。

所述检测羊多头蚴的酶联免疫试剂盒的酶标抗抗体是羊脑多头蚴病阳性羊血清为一抗，辣根过氧化物酶偶联兔抗羊IgG为二抗。

所述检测羊多头蚴的酶联免疫试剂盒的诊断膜片1.1是包被有包被原的硝酸纤维素膜NC，阴性对照血清1.3是未患羊脑多头蚴病的阴性对照血清，阳性对照血清1.4是羊脑多头蚴病阳性对照血清，底物溶液1.5是DAB缓冲液。

洗涤液1.6是洗涤缓冲液(pH7.4PBST，含0.05％Tween-20)由NaCl 8.0g、KCl0.2g、KH₂PO₄0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、Tween-200.5mL加蒸馏水至1000mL即成。以上属液体成分的均分装在小瓶内，并置于试剂盒中。

依据以上所述的羊多头蚴基因重组抗原蛋白的一种制备方法，其步骤如下：

(1)从羊脑内采到的多头蚴原头节为原料，提取总RNA，RT-PCR技术扩增出目的基因的全序列，命名为Tm7基因。

(2)PCR产物测序正确后，克隆出目的基因的开放阅读框ORF，将其连接到pMD18-T载体，转化到大肠杆菌DH5α后测序，发现克隆到的目的基因的开放阅读框为207bp，编码68个氨基酸。

(3)将此片段亚克隆入pET-32a(+)载体，构建重组表达质粒pET-32a-Tm7，经转化大肠杆菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达，用SDS-PAGE和Western-blot检测表达产物。

(4)将目的蛋白样品过Ni-Charged Resin柱纯化，收集洗脱峰蛋白液，进行电泳检测，获得纯度很高的目的蛋白即为基因重组抗原蛋白。