[发明专利]UDP-葡萄糖基转移酶突变体的编码基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种UDP-葡萄糖基转移酶突变体的编码基因及其应用。 

背景技术

高山红景天(Rhodiola sachalinensis A.Bor)又名库页红景天，是景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodiola rosea L.)植物，为多年生草本或亚灌木，常具肉质匍匐根状茎，是长白山珍稀药用植物之一。红景天属植物的主要活性成分为红景天甙(salidroside)和甙元酪醇(tyrosol)等，现代药理学研究结果表明红景天甙具有明显的抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗辐射、抗病毒、延缓机体衰老等功效，对于航天、深海、沙漠、高原、体育等行业是一种极具开发应用前景的环境适应药物，同时对高辐射从业人员、微机使用频繁人员、强脑力劳动者、中老年人群具有积极的滋补保健作用。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种UDP葡萄糖基转移酶突变体的编码基因及其应用。 

本发明提供的蛋白质，人工合成，命名为RsmUGT73B6，是如下1)或2)的蛋白质： 

1)由序列表中的序列4的氨基酸残基序列组成的蛋白质； 

2)将序列表中的序列4氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有UDP-葡萄糖基转移酶功能和/或与红景天甙合成相关的由1)衍生的蛋白质。 

上述序列4由480个氨基酸残基组成，上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。 

所述蛋白质的编码基因RsmUGT73B6也是本发明保护的范围。 

所述编码基因为如下1)-5)中任一所述的DNA分子： 

1)序列表中序列3所示的DNA分子； 

2)序列表中序列3自5’末端第1位到第1443位核苷酸所示的DNA分子； 

3)序列表中序列3自5’末端第4位到第1443位核苷酸所示的DNA分子； 

4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码具有UDP-葡萄糖基转移酶功能和/或与红景天甙合成相关的蛋白所示的DNA分子； 

5)与1)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至 少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有UDP-葡萄糖基转移酶功能和/或与红景天甙合成相关的蛋白所示的DNA分子。 

上述序列3由1564个核苷酸组成，OFR的序列为序列3的自5’末端第1-1443位核苷酸序列。 

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。 

含有上述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系、表达盒或重组病毒也是本发明保护的范围。 

所述重组载体为将上述编码基因插入载体pET-30b(+)的NdeI和SalI识别位点间得到的重组载体。 

扩增上述编码基因全长或任一片段的引物对也是本发明保护的范围；所述引物对如下所示：一条引物序列如序列表中序列5所示，另一条引物序列如序列表中序列6所示。 

上述蛋白质在合成红景大甙中的应用，上述编码基因在合成红景天甙中的应用都是本发明要保护的范围。所述合成红景天甙为体外合成红景天甙。 

本发明的另一个目的是提供一种制备苯亚甲基丙酮的方法。 

本发明提供的方法为以酪醇和UDP-葡萄糖为底物，在权利要求1所述蛋白质的催化作用下，得到红景天甙。 

本发明的实验证明，采用定点突变(V361T/T373I/G376S)技术对UGT73B6进行了突变研究，UGT73B6的三联体突变体命名为RsmUGT73B6，结果显示，突变后的RsmUGT73B6红景天甙合成能力较UGT73B6提高了1.9倍。RsmUGT73B6突变基因及其应用为红景天甙的生物合成提供了直接有效的技术及应用基础。 

附图说明

图1为RsmUGT73B6原核表达载体的构建 

图2为原核表达载体的NdeI和BamHI双酶切鉴定 

图3为UGT纯化SDS-PAGE分析 

图4为HPLC检测结果 

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。