[发明专利]一种促进奶牛乳腺上皮细胞发育及泌乳的方法

权利要求书

1.一种促进奶牛乳腺上皮细胞发育及泌乳的方法，其特征在于促进奶牛乳腺上皮细发育及泌乳的方法按以下步骤进行：一、取荷斯坦牛泌乳期组织样并采用胶原酶-胰酶消化法分离上皮细胞，然后置于细胞生长培养液中培养3代，得体外培养的乳腺上皮细胞；二、根据Kcnma1基因的mRNA序列设计引物，PCR扩增出Kcnma1基因的全序列，然后与pGEM-T载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得克隆载体质粒；三、pSV-β-GalactosidaseControl Vector质粒和克隆载体质粒分别使用AgeI和XbaI进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建表达载体，再用表达载体转染体外培养的乳腺上皮细胞，使Kcnma1基因在体外培养的乳腺上皮细胞中过量表达，即完成奶牛乳腺上皮细发育及泌乳的促进；其中步骤一中细胞生长培养液由90ml的DMEM高糖培养基、10ml的FBS和10ml浓度为50mg/ml的胰岛素、100μl 10万单位/ml的青霉素和100μl 10万单位/ml的链霉素组成；步骤二中PCR扩增所用上游引物为5′-GCACCGGTTGCTAGCTATGGCAAATGGTGGC-3′，下游引物为5′-GCTCTAGAGGCAGTGGATACACACATCAGAG-3′，而且在上下游引物的5′端分别添加了限制性内切酶AgeI和XbaI的酶切位点。

2.根据权利要求1所述的一种促进奶牛乳腺上皮细胞发育及泌乳的方法，其特征在于步骤二中PCR扩增的反应体系为25μL反应体系，由下列成分组成：

成分                        用量

TaKaRa Ex Taq(5U/μl)       0.25μl

10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)    5μl

dNTP Mixture(各2.5mmol/L)   4μl

cDNA模版                    1μl

上游引物(20μmol/L)         1μl

下游引物(20μmol/L)         1μl

灭菌三蒸水                  12.75μl

PCR扩增条件为：94℃变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸5min，共38个循环，再72℃延伸10min，4℃保温。

3.根据权利要求1或2所述的一种促进奶牛乳腺上皮细胞发育及泌乳的方法，其特征在于步骤二中连接的体系如下：

成分                        用量

Kcnma1基因的全序列          3.0μL

pGEM-T载体                  1.0μL

2×Buffer                   5.0μL

T₄连接酶                    1.0μL  。

4.根据权利要求3所述的一种促进奶牛乳腺上皮细胞发育及泌乳的方法，其特征在于步骤二中PCR扩增出Kcnma1基因的全序列为

gttgctagct atggcaaatg gtggcggcgg cggcggcggc ggcggcggag gcagcagtct  60

tagaatgagc agcaatatcc acgcgaacca tctcagccta gacgcgtcct cctcctcctc  120

ttcttcctcc tcctcctctt cctcgtcgtc ctcggtccac gagcccaaga tggatgcgct  180

catcatcccg gtgaccatgg aggtgccgtg cgacagccgg ggccaacgga tgtggtgggc  240

tttcctggcc tcctccatgg tgactttctt cggcggcctc ttcatcatct tgctctggag  300

gacgctcaag tacctgtgga ccgtttgctg ccactgcggg ggcaaaacga aggaggccca  360

gaagattaac aatggctcaa gccaggcaga tggcactctc aagccagtgg atgaaaaaga  420

ggagacggtg gcagccgagg tcggctggat gacctccgtg aaagactggg cgggggtgat  480

gatatctgcc cagacgctga ctggcagagt cctggttgtc ttagtctttg ctctcagcat  540

tggtgcactt gtaatatact tcatagattc gtcaaaccca atagaatcct gccagaattt  600

ctacaaagat ttcacattac agatcgacat ggcgttcaac gtattcttcc ttctctactt  660

tggcttgcgg tttattgcag ccaacgataa gctatggttc tggcttgaag tgaactctgt  720

ggtagatttc ttcacggtcc cccctgtgtt tgtgtccgtg tacttaaaca gaagttggct  780

tggtttgaga tttttaagag ctctcagact gatccagttt tcagaaattt tacagtttct  840

gaatatcctg aaaacaagta attccatcaa gctggtgaat ctgctctcca tttttatcag  900

cacgtggctc acagcagccg ggttcatcca tttggtggag aattcagggg acccatggga  960

aaatttccaa aacaaccagg ctcttaccta ctgggaatgt gtctatctgc tcatggtgac  1020

catgtccact gttggttacg gggatgttta tgcaaaaacc acgctcgggc gtctcttcat  1080

ggtcttcttc atcctcgggg gactggccat gtttgccagc tacgtccctg aaatcataga  1140

gttaatagga aaccgcaaga aatacggggg ctcctatagt gcggttagtg gaagaaagca  1200

catagtggtc tgtggacaca tcacactgga gagcgtttcc aacttcctga aggactttct  1260

gcacaaggac cgggacgatg tcaatgtgga gatcgtcttt cttcacaaca tctcccctaa  1320

cctggagctg gaagccttgt tcaaacgaca ttttactcag gtggagtttt atcagggttc  1380

agtcctcaat ccacatgatc ttgcaagagt caagatagag tcagcagatg cgtgcctgat  1440

ccttgccaat aagtactgcg cagaccccga tgctgaagat gcctccaaca tcatgagagt  1500

catctccata aagaactacc acccgaagat aagaatcatc actcagatgc tgcagtatca  1560

caataaggcc catctgctaa acatcccgag ctggaattgg aaagaggggg atgatgcaat  1620

ctgcctcgca gaactgaagc tggggttcat cgcccagagc tgcctggctc aagggctctc  1680

caccatgctc gccaacctct tctccatgag gtcattcata aagattgagg aagacacgtg  1740

gcagaaatac tacttggaag gagtctcaaa tgaaatgtac acagaatatc tctccagtgc  1800

cttcgtgggt ctgtccttcc cgactgtttg tgagctgtgt tttgtgaagc tcaagcttct  1860

catgatagcc attgagtaca agtccgccaa tcgagagagc cgtatattaa ttaatcctgg  1920

aaaccatctt aagatccaag aaggtacttt aggatttttc atcgcaagtg atgccaaaga  1980

agttaaaagg gcattttttt actgcaaggc ctgtcatgat gacatcacgg atcccaaaag  2040

gataaaaaaa tgcggctgca aacggcttga agatgaacag ccgtcgacac tgtcacccaa  2100

aaaaaagcag cgcaacggag gcatgcggaa ctcacccagc tcgtcgccca agctgatgag  2160

gcatgacccc ttgttaattc ctggcaatga tcagattgac aacatggact ccaatgtgaa  2220

gaaatatgac tctactggga tgtttcactg gtgtgcgccc aaggagatag agaaagtcat  2280

cctgacccga agtgaagctg ccatgaccgt cctgagcggc cacgtggtgg tctgcatctt  2340

tggcgacgtc agctctgccc tgattggcct tcggaacctg gtgatgccgc tccgtgccag  2400

caactttcac taccacgagc tcaagcacat cgtgtttgtg ggctccatcg agtacctcaa  2460

gcgggaatgg gagacactgc ataacttccc caaggtttcc atcttgcctg gtacgccatt  2520

aagtcgggct gatttaaggg ccgtcaacat caacctctgt gacatgtgcg ttatcctgtc  2580

agccaatcag aataatattg atgatacttc gctgcaggac aaggaatgca tcttggcgtc  2640

actcaacatc aaatctatgc agtttgatga cagcatcggg gtcttgcagg ctaattccca  2700

agggttcaca cctccaggaa tggaccgatc ctcaccagat aacagcccgg tacatgggat  2760

gttacgccag ccctccatca ctactggggt caacatcccc atcatcactg aactagtgaa  2820

cgatactaat gttcagtttt tggaccaaga cgatgacgat gaccccgaca cagaactgta  2880

cctcacgcag ccgtttgcat gtgggacagc gttcgccgtc agtgtcctgg attcactcat  2940

gagcgcaaca tacttcaatg acaacatcct taccctgata cggaccctgg tgactggagg  3000

agccacacca gagctggagg ctttgatcgc tgaggagaat gcactccgcg ggggctacag  3060

caccccccag acgctggcca acagggaccg ctgccgtgtg gcccagttag cgctgctgga  3120

cgggcccttt gcggacctgg gggatggtgg ttgttatggt gatctgttct gcaaagctct  3180

gaaaacatac aatatgcttt gttttggaat ttatcggctg agagatgctc acctcagcac  3240

ccccagccag tgcacgaaga ggtatgtcat caccaacccc ccgtacgagt ttgagctcgt  3300

gccgacggac ctgatcttct gcttaatgca gtttgaccac aacgccggcc agtcccgggc  3360

cagcctctcc cattcctccc actcgtccca gtcctctagc aagaagagct cctccgtcca  3420

ctccatccca tccacggcaa accgacagaa ccggcccaag tcccgggagt cccgagacaa  3480

acagaagtac gtgcaggaag agcggctctg atgtgtgtat ccactgcctc  3530。