[发明专利]一种促进奶牛乳腺上皮细胞发育及泌乳的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种促进乳腺发育及泌乳的方法。

背景技术

奶牛是畜牧养殖业中重要的经济动物之一，奶牛的产奶量和奶品质是衡量养殖水平和经济效益的重要标准。我国为奶牛养殖大国，存栏奶牛达1216万头，但奶牛的平均年单产水平只有3884kg，美国的奶牛单产则可达7767kg，以色列为8615kg，料奶比可达到1∶3。产奶量低、乳脂和乳蛋白含量相对不高、产出投入比较低的是制约我国奶牛养殖业发展的主要因素。

依据《国家中长期科学和技术发展规划纲要》、《国家“十一五”科学技术发展规划》和《863计划“十一五”发展纲要》，通过运用各种生物信息学手段和基因操作技术，筛选出影响泌乳性状的重要功能基因，对促进我国奶牛养殖业发展具有重大的理论意义和实际应用价值。乳腺是重要的泌乳功能器官，乳腺内基因表达水平受遗传和环境因素的双重调控。泌乳重要功能基因的表达水平变化能够调控乳腺的生长发育、分化和组织重建，以及乳汁合成、分泌和运输等重要的生理过程。乳腺上皮细胞是泌乳的基本结构和功能单位，通过研究其内泌乳相关基因的表达，可以为揭示乳腺特异性表达基因如何被激活、泌乳重要功能基因如何起始和维持泌乳、调控乳汁组分提供理论依据。同时，有助于建立一种调控奶牛泌乳重要功能基因表达水平并显著提高产奶量的乳腺生物调控技术。

目前奶牛功能基因组学研究处于起步阶段，对影响牛健康、疾病、肉奶品质相关基因的功能研究是未来的研究重点。国内对泌乳相关的奶牛功能基因的研究工作基本处于空白状态，国外也只有较少的研究报告，获得的泌乳功能基因数量较少。采用现代功能基因组学研究方法，来研究泌乳这一奶牛重要的生产指标相关的基因，以及奶牛从饲料所获得的各种营养物质同这些控制泌乳的重要基因之间的相互作用具有重要的意义。可为奶牛产奶性能的提高以及营养物质的合理供给研究提供重要的技术理论依据和技术手段。

发明内容

本发明提供了一种促进奶牛乳腺上皮细胞发育及泌乳的方法。

促进奶牛乳腺上皮细发育及泌乳的方法按以下步骤进行：一、取荷斯坦牛泌乳期组织样并采用胶原酶-胰酶消化法分离上皮细胞，然后置于细胞生长培养液中培养3代，得体外培养的乳腺上皮细胞；二、根据Kcnma1基因的mRNA序列设计引物，PCR扩增出Kcnma1基因的全序列，然后与pGEM-T载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得克隆载体质粒；三、pSV-β-Galactosidase Control Vector质粒和克隆载体质粒分别使用AgeI和XbaI进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建表达载体，再用表达载体转染体外培养的乳腺上皮细胞，使Kcnma1基因在体外培养的乳腺上皮细胞中过量表达，即完成奶牛乳腺上皮细发育及泌乳的促进；其中步骤一中细胞生长培养液由90ml的DMEM高糖培养基、10ml的FBS(胎牛血清)和10ml浓度为50mg/ml的胰岛素、100μl 10万单位/ml的青霉素和100μl 10万单位/ml的链霉素组成；步骤二中PCR 扩增所用上游引物为5′-GCACCGGTTGCTAGCTATGGCAAATGGTGGC-3′，下游引物为5′-GCTCTAGAGGCAGTGGATACACACATCAGAG-3′，而且在上下游引物的5′端分别添加了限制性内切酶AgeI和XbaI的酶切位点。

钾大电导钙活化通道亚家族M，α成员1(potassium large conductance calcium-activated channel，subfamily M，alpha member 1，Kcnma1)编码一种BK钾离子通道蛋白；它由两个亚基组成，分别负责通道形成的α亚基和起调节作用的β亚基；细胞内钙离子调节α和β亚基之间的相互作用；钾通道通过膜的去极化或者提高细胞内Ca²⁺浓度被激活，调节K⁺的运输；它也可以被细胞内Mg²⁺激活；它的激活将缓冲细胞内Ca²⁺浓度和/或膜电位去极化，因此可以使膜电位复极化。

本发明中Kcnma1基因在泌乳期奶牛乳腺中高表达，通过基因过表达实验和RNA干扰实验在细胞水平验证了Kcnma1基因确实是能够促进奶牛乳腺上皮细胞发育以及乳产生的重要功能基因。