[发明专利]利用Flp-Frt系统建立嵌套型组织特异性表达的Cre工具鼠

权利要求书

1.利用双转基因和Flp-Frt技术，在CRE的翻译起始密码子前加入一个“STOP“原件，可以抑制下游CRE的表达。在“STOP“原件的上下游各加上一个Frt序列，利用Flp重组酶，可以特异的删除两个Frt序列间的“STOP“原件，这时其下游的Cre重组酶可以表达。我们在Cre和Flp的表达质粒前各加上组织特异性的启动子，只有在这两个启动子都表达的组织Cre才会表达，大大提高Cre表达的组织特异性。

2.真核表达Flp重组酶的工具载体pBS-Pr-Flp的构建。这个质粒包括Flp重组酶编码序列，β珠蛋白内含子(简称intron)。

3.真核表达Cre重组酶的工具载体pBS-Pr-STOP-Cre的构建，包括：步骤一、以pBS302载体为模板，PCR扩增“STOP“片段，同时在引物两端引入Frt序列，PCR的结果是”STOP“片段两段加上两个同向的Frt序列。将两端有Frt序列的“STOP“片段(仍称为”STOP“片段)插入pBS-Cre质粒的Cre片段前面。

步骤二、将兔β珠蛋白内含子(简称intron)片段插入pBS-STOP-Cre质粒的Cre片段前面。

步骤三、在intron片段的上游和polyA加尾信号的下游加入绝缘子(insulator片段，从pInsulator载体得到)。

4.FoxP3-Flp/CD4-STOP-Cre双转基因小鼠的建立。包括：

步骤一、FoxP3-Fl p转基因载体的构建。我们使用同源重组的方法，把FoxP3上游10K的启动子区序列从BAC(RP23-143D8)上重组到Fl p上游(参见Zhou et al.，JEM，2008)使FoxP3的翻译起始密码子ATG与Flp片段的ATG密码子重合，这样Flp序列可以在FoxP3启动子驱动下，使用FoxP3的翻译框进行表达。

步骤二、CD4-STOP-Cre转基因载体的构建。我们使用酶切连接的方法将CD4的启动子插入pBS-Pr-STOP-Cre载体STOP片段的上游为启动子预留的位置。CD4的启动子分为三个部分：核心启动子部分，增强子部分和沉默子部分(Sawada et al.，cell，1994)。我们把组合好的CD4通过酶切连接到pBS-Pr-STOP-Cre载体STOP片段的上游为启动子预留的位置。

步骤三、对FoxP3-Flp和CD4-STOP-Cre两个载体进行线性化。线性化的片段以摩尔比一比一进行原核注射。根据转基因插入的特点，可以得到FoxP3-Flp和CD4-STOP-Cre质粒交替插入一个位点的转基因品系，后代不会分离。

步骤四、用Flp和Cre特异性PCR引物鉴定基因型，双阳性小鼠称为Founder。

步骤五、每只Founder鼠，与B6小鼠交配以保持小鼠品系。同时与ROSA-GFP小鼠交配以鉴定Cre的组织特异性表达。带有ROAS-EGFP的小鼠，可以在表达Cre的细胞中特异的表达EGFP。因此我们可以通过EGFP的表达情况来指针Cre的表达。