[发明专利]利用Flp-Frt系统建立嵌套型组织特异性表达的Cre工具鼠

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的嵌套型组织特异性Cre工具鼠的建立，具体涉及利用Flp-Frt系统和双转基因技术建立嵌套型组织特异性表达的Cre工具鼠的新技术，属于生物技术领域。 

背景技术

条件性基因敲除技术是研究基因功能，并进一步应用于医药研究的一个重要手段。组织特异性表达Cre转基因鼠是条件性基因敲除技术重要工具被广泛应用于科学研究和医药研究。Cre重组酶于1981年由Sternberg发现于P1噬菌体。基因有1029个碱基(Gene ID：2777477)，编码大小约38K的蛋白，属于λInt酶超基因家族(integrase superfamily)，是一种位点特异性重组酶，它能识别部分回文的loxP序列(5′-ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT-3′)，并通过分子间重组将相同方向的LoxP序列间的核苷酸序列有效切除。20世纪80年代中期，分子生物学家首先注意到这种酶并把它应用到高等生物中，他把一段两侧带有LoxP位点的基因导入培养细胞的基因组中，同时转入Cre基因使蛋白在细胞内表达，结果证明LoxP位点之间的片段被切除。1994年Gu.H等首次将Cre-LoxP系统应用到基因打靶中，建立了组织特异性基因打靶小鼠。常规的全体基因敲除由于会破坏胚胎发育所必须的基因而导致胚胎期致死，从而无法获得成体动物进行下一步研究。组织特异打靶避免了常规基因敲除的缺陷。通过同源重组的方式将LoxP序列装入具有重要功能序列两侧的内含子中，就可以产生条件性靶向标记小鼠(floxed mice)，因为LoxP不会影响目标基因的转录和翻译。组织特异性基因敲除小鼠可以通过floxed小 鼠与组织特异表达Cre小鼠的杂交产生。目标基因将会在表达Cre的组织细胞中被破坏，而在其他Cre没有表达的组织细胞中保持原样。目前世界上已经构建的Cre表达小鼠品系已有数百种。构建组织特异性Cre表达小鼠大部分采用转基因的手段，由组织特异性启动子引导Cre在特定组织中表达。因为转基因方法中导入的DNA片段采取随机插入的形式，使得插入位点和插入的拷贝数都无法控制。转入基因可能插入异染色质区导致基因沉默无法表达；也可能进入活跃表达的区域导致背景表达量过大，特异性不明显。 

Flp/Frt系统是Cre/loxP系统在真核细胞内的同源系统。与Cre/loxP系统相同，Flp/Frt也是由一个重组酶(Flp)和一段特殊的DNA序列组成(Frt)。其中.重组酶Flp是酵母细胞内的一个由423个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需要任何辅助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的另一个成分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点非常相似，同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8bp的核心序列构成(5′-GAAGTTCCTATTCtctagaaaGTATAGGAACTTC-3′.)。Flp可以介导两个同方向的Frt序列之间的核苷酸序列通过同源重组发生有效的切除。目前，Flp/Frt系统也被广泛的应用于以果蝇和小鼠为模式动物的科学研究中。 

“STOP“原件是由三部分组成：550bp的酵母基因His3C端序列，825bp的SV40PolyA加尾信号，以及一段人工合成的寡核苷酸序列(5’-GATCTGACA-ATGGTAAGTAACCT-3’，这里ATG是一个假的翻译起始序列，GTAAGT是一个5’的剪接供点)。将这个原件加到所需表达的编码序列前面，可以有效的阻止下游编码序列的表达。在“STOP“原件两边加上同方向的Frt序列，通过表达Flp重组酶，就可以在Flp重组酶表达的细胞中切除“STOP“原件，使得下游的编码序列可以表达。 

内含子(Intron)属于基因中非翻译序列，存在于外显子(Exon)之间。很多内含子具有调控基因转录以及未成熟mRNA剪切的作用。兔β珠蛋白内含子是兔β珠蛋白基因中的一段内含子，将其置于启动子后、翻译起始位点之前可以增强外源基因在真核系统中的表达。绝缘子(Insulator)是一类DNA元件，可以使启动子不受附近调控元件的干扰。本发明中所用的绝缘子是鸡β球蛋白基因位点5’末端的一段序列，它可以在真核表达中起到绝缘子的作用，即保证绝缘子之间的转基因序列不受插入位点附近其他DNA原件的影响。