[发明专利]草鱼出血病疫苗蛋白表达载体及其构建方法

权利要求书

1.一种草鱼出血病疫苗蛋白表达载体，其特征在于，包括以下部分：

(1)AcMNPV多角体启动子控制的VSV G表达阅读框；

(2)白斑病毒ie1启动子控制的VP7表达阅读框。

2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，该载体是由权利要求1所述的两个部分，同时用基因克隆的办法，插入pFastBac1穿梭载体中构成。

3.一种整合有如权利要求1所述的表达载体的重组杆状病毒，其特征在于，该病毒是vAc-G-Vp7，由权利要求2所述的表达载体，通过在宿主菌DH10BAC^TM中定点转座的办法，整合进杆状病毒基因组得到。

4.一种草鱼出血病疫苗蛋白表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)VSV G阅读框的克隆：

A：pFastBac1中的多角体启动子首先用SnaB I和Sal I切除；

B：用PCR的方法从Bacmid基因组中扩增得到多角体启动子，所用两条引物分别是：

P1：5’-TCCCCCGGGGGATGGTTGGCTACGTATACTCCG-3’

P2：5’-CGCGGATCCGGTTTCG GACCGAGATCCGC-3’；

C：将B步骤得到的多角体启动子用Sma1和Sal 1双酶切，克隆进pFastBac1载体的SnaB 1和Sal 1位点中，得到含新的多角体启动子的pFastBac1载体；

D：用PCR的方法从pVSV-G载体中扩增，得到VSV G cDNA及其末端的β-globin终止子，所用两条引物分别是：

S1：5’-CGCGGATCCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGC-3’

S2：5’-CCCAAGCTTCCAACACACTATTGCAATGAA-3’；

E：将D步骤中用PCR方法扩增出来的VSV G片段用SnaB I和Sal I进行双酶切，回收后的片段直接插入含新多角体启动子的pFastBac1载体；

对转化平皿上的菌落用PCR的方法进行阳性克隆筛选。

2)VP7阅读框的克隆：

A：自对虾白斑综合症病毒基因组ie1基因的启动子区扩增ie1启动子；扩增引物两端设计限制性内切酶位点SnaB I和Sal I，插入到pFastBac1载体的Stu I和Sal I位点中；

B：Vp7基因用RT-PCR的办法扩增自草鱼出血病病毒标准株873株的基因组，所用引物为：

V1：5′-ATAAGAATGCGGCCGGTAATGCCACTTCACATGATTCCGCA-3′

V2：5′-CTAGTCTAGACGCATTAATCGGATGGCTCCAC-3′；

然后插入到含有ie1启动子序列的pFastBac1载体中，插入位点是Xba 1和Not 1。