[发明专利]一种弓形虫循环抗原双抗夹心ELISA检测方法

权利要求书

1.重组蛋白MIC-10，其特征在于：其为MIC-10A、MIC-10B或MIC-10C，其核苷酸序列依次分别如：SEQ ID No.1所示、SEQ ID No.2所示或SEQ ID No.3所示。

2.重组蛋白MIC-10的制备方法，它包括：

1)人工合成引物；

制备重组蛋白MIC-10A基因的引物为：

FW：GATCGGATCCGATTTTTTTAACGATTAC

RV：GATCAAGCTTTCATTCACGAAGTCCTCTTTTC

制备重组蛋白MIC-10B基因的引物为：

FW：GATCGGATCCGCCGCTGAGCGTGAGGAGAAG

RV：GATCAAGCTTTCACATTGATTTCCTGCG

制备重组蛋白MIC-10C基因的引物为：

FW：GATCGGATCCGATTTTTTTAACGATTAC

RV：GATCAAGCTTTCACATTGATTTCCTGCG

2)提取RH株弓形虫基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得基因片段，克隆到PMD-18T载体上；

3)将MIC10A基因片段插入表达载体PET28A中构建重组表达质粒PET28A-MIC-10A、PET28A-MIC-10B或PET28A-MIC-10C；

4)将重组表达质粒PET28A-MIC-10A转入BL21(DE3)中进行表达，得重组融合蛋白MIC-10A、MIC-10B或MIC-10C，用镍柱纯化重组蛋白。

3.抗重组蛋白MIC-10多克隆抗体，是由下述方法制备的：

用重组蛋白MIC-10免疫3月龄雌性家兔，皮下3点注射，免疫剂量500ug/只/次，间隔21d免疫，共免疫3次，第1次采用弗氏完全佐剂，第2、3次采用弗氏不完全佐剂，第3次免疫后21天，心脏放血，37℃放置1小时后，4℃过夜，次日3000转离心15分钟，取上清，用protein A层析柱纯化兔抗MIC10，按说明书进行，纯化后的IgG用PBS透析3次，用BCA法测定蛋白浓度，-80℃冻存；

所述的重组蛋白MIC-10为MIC-10A或MIC-10B。

4.一种弓形虫循环抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒，它包括：包被抗体、生物素标记的检测抗体、阳性对照、洗涤液、封闭液、酶标亲和素、底物、终止液和样本稀释液，其特征在于：所述的包被抗体为兔抗重组蛋白MIC-10AIgG、检测抗体为兔抗MIC-10BIgG或包被抗体为兔抗重组蛋白MIC-10BIgG、检测抗体为抗重组蛋白MIC-10AIgG；阳性对照为重组蛋白MIC-10C。

5.根据权利要求4所述的一种弓形虫循环抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：封闭液为含1％BSA和10％马血清的TBS，底物为TMB，终止液为2M硫酸。

6.一种弓形虫循环抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒使用方法，它包括：

1)加入100μl纯化的5ug/ml兔抗MIC-10AIgG包被ELISA反应板，4℃孵育过夜；

2)用TBST洗5次，每次5分钟；

3)每孔加入300μl封闭液封闭，37℃孵育30分钟；

4)用TBST洗5次，每次5分钟；

5)每孔加入100μl待检血清样品，37℃孵育1小时；

6)用TBST洗5次，每次5分钟；

7)每孔加入100μl生物素标记的兔抗MIC-10BIgG，37℃孵育1小时；

8)用TBST洗5次，每次5分钟；

9)加入酶标亲和素，37℃孵育30分钟；

10)用TBST洗5次，每次5分钟，孵育10分钟；

11)每孔加入100ul底物，室温避光显色30分钟；每孔加入50ul 2M硫酸终止反应；

12)读板，记录OD值；根据标准曲线，计算待检血清样品中的MIC10含量。

7.根据权利要求6所述的一种弓形虫循环抗原双抗夹心ELISA检测试剂盒使用方法，其特征在于：所述的包被抗体为免抗重组蛋白MIC-10BIgG、检测抗体为免抗重组蛋白MIC-10AIgG。