[发明专利]一种弓形虫循环抗原双抗夹心ELISA检测方法

说明书

技术领域

本发明属生物检验检疫技术领域，具体地说，构建重组蛋白，利用重组蛋白免疫制备的抗体，建立一种弓形虫循环抗原双抗夹心ELISA检测方法。

背景技术

弓形虫(toxoplasma)是一种专性细胞内寄生性原虫，具有广泛的宿主群并在世界范围内流行，引起人兽共患寄生虫病。艾滋病患者、器官移植及恶性肿瘤患者等免疫功能损伤或抑制者，弓形虫作为一种机会感染因子，可致患者死亡。弓形虫病不但是医学上的一种重要疾病，更重要的是它是影响人类优生优育的一个重要生物因子。

人体感染了弓形体，多数可能是无症状的带虫者，仅少数人发病。该病临床表现复杂，轻者为隐性感染，重者可表现为多器官的严重损害，如弓形虫脑病、眼病、肾病、肝病、肺病及弓形体心肌炎等各系统的病变。值得注意的是，弓形体对妊娠有很重要的影响。被弓形体感染的孕妇，不论其有无临床症状，常可通过胎盘将弓形虫传给胎儿，从而直接影响胎儿的发育，使胎儿严重致畸，甚至死亡，亦可发生流产、死产、早产或增加妊娠合并症。感染发生得越早，胎儿受损越严重。在妊娠中三个月感染，多会出现死胎、早产和严重的脑、眼疾患；在妊娠晚期，因胎儿已逐渐成熟，此时母体如受到感染，胎儿可发育正常，亦可出现早产或出生后才出现症状，表现为各系统不同程度的损坏。据报道，偶见孕期感染弓形虫的胎儿在出生后数年甚至成人后才表现出弓形虫病。

据统计全世界四分之一人口受到弓形虫病的威胁，美国每年有400-4000例先天性弓形虫病发生。我国有6100多万人感染弓形虫病，其中育龄妇女有1300万-1500万，弓形虫是宫内感染的病原体之一，每年约有9万名受弓形虫损害的新生儿出生，孕妇弓形虫感染率为6.6％-32.9％，通过胎盘感染胎儿，严重影响胎儿生长发育。在畜牧业方面，怀孕动物出现流产，猪感染弓形虫会引起大批死亡。

可见弓形虫对人类危害极大，尤其是孕妇，在孕前和孕期(妊娠前三个月较好)最好做弓形虫的血清学检测。

ELISA是当前诊断弓形虫感染应用最广的技术，当前商品化的试剂盒主要包括检测抗体和检测循环抗原两大类。其中抗体检测又包括IgG检测试剂盒和IgM检测试剂盒两种。由于IgM抗体是在血清中早期出现，且停留时间较短，所以检测IgM抗体被用于多种疾病的早期诊断；而IgG出现较晚，是慢性期或既往感染的标志。IgG检测的最大缺点在于不能判定是当前感染还是既往感染。IgM检测尽管与当前感染有着很好的相关性，但不适合免疫功能低下人群和孕期检测，这是因为这些人群机体免疫功能低下，检测敏感性低，造成假阴性。

循环抗原(CAG)是弓形虫急性感染期虫体自身排泄和裂解产物，在虫体的侵入和繁殖过程中，由虫体分泌出来，因此检测CAG可以更加准确地诊断弓形虫的感染。而MIC10被证实是在虫体感染过程中分泌的循环抗原(CAG)中的一种主要蛋白，体外培养时虫体大量分泌该蛋白到培养基中，因此检测该蛋白不仅可对感染定性，而且还可通过对该蛋白定量来确定感染强度。

发明内容

本发明的目的是提供重组蛋白MIC-10。

所述的重组蛋白MIC-10为MIC-10A、MIC-10B或MIC-10C，其核苷酸序列依次分别如：SEQ ID No.1所示、SEQ ID No.2所示或SEQ ID No.3所示；

重组蛋白MIC-10的制备方法，它包括：

1)人工合成引物；

制备重组蛋白MIC-10A引物为：

FW：GATCGGATCCGATTTTTTTAACGATTAC

RV：GATCAAGCTTTCATTCACGAAGTCCTCTTTTC

制备重组蛋白MIC-10B引物为：

FW：GATCGGATCCGCCGCTGAGCGTGAGGAGAAG

RV：GATCAAGCTTTCACATTGATTTCCTGCG

制备重组蛋白MIC-10C引物为：

FW：GATCGGATCCGATTTTTTTAACGATTAC

RV：GATCAAGCTTTCACATTGATTTCCTGCG

2)提取RH株弓形虫基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得基因片段，克隆到PMD-18T载体上；

3)将MIC10A基因片段插入表达载体PET28A中构建重组表达质粒PET28A-MIC-10A、PET28A-MIC-10B或PET28A-MIC-10C；