[发明专利]一种制备灰树花蛋白聚糖的方法

说明书

技术领域

本发明属于药物领域，具体涉及一种利用灰树花菌体自身内源酶系和外源酶制备灰树花蛋白聚糖的方法。

背景技术

灰树花是一种重要的药食两用真菌，灰树花子实体多数作为食用菌直接食用，部分经过简单的提取、加工制成功能食品，没有对其主要成分做进一步的分离和深加工，不能形成真正意义上的综合利用。

灰树花蛋白聚糖存在于细胞壁中，是一种极富生物活性的物质，已证实其对肿瘤、肝炎、糖尿病、心脑血管等疑难病都有较好的治疗或辅助治疗效果，还是一种良好的生物反应调节剂，它能够通过刺激免疫系统而提高机体的免疫能力，在相互依赖的机体系统中，对维持体内平衡起关键作用，帮助机体适应环境和调节压力。

灰树花细胞壁中除含有大量的蛋白质外，还含有甘露糖蛋白、β-葡聚糖、其他杂多糖、纤维素、半纤维素和几丁质等成分。目前已被应用的产品主要有灰树花多糖，灰树花多糖实际上是多种多糖成分和多糖蛋白的混合物，尚未有灰树花蛋白聚糖的生产和应用。

目前灰树花多糖的提取方法较多，主要有热水法、碱法、酸碱一体法、超声波法和酶法等，大多数采用简单的热水提取或碱提取，经乙醇沉淀得到灰树花多糖粗品，加工成产品销售，纯品灰树花多糖采用层析技术获得，大多停留在实验室阶段。而灰树花蛋白聚糖的提取技术报道很少。

在中国专利(CN：1255429C)中披露了一种灰树花蛋白聚糖的制备方法，该方法采用热水提取灰树花子实体，再用碱性溶液继续处理子实体，并对其提取液进行中空纤维超滤，经浓缩干燥得到灰树花蛋白聚糖干粉。由于未经过纯化过程，此类灰树花蛋白聚糖的含量较低，一般只能达到60％左右，而且含有多种非生物活性的杂质，限制了灰树花蛋白聚糖的活性发挥。同时，产生大量强碱性液体，对环保造成压力。

发明内容

本发明针对上述技术存在的不足，提供一种以灰树花菌体为原料制备灰树花蛋白聚糖的方法，具体步骤包括菌体自溶、酶解，并对酶解提取液微滤、超滤、层析、干燥，得到灰树花蛋白聚糖，上述的制备工艺简单，工艺参数易于控制，产物灰树花蛋白聚糖的得率、纯度都比较高，适合工业化生产，所得灰树花蛋白聚糖可广泛应用于医药、食品、食品添加剂及其它轻工领域。

本发明提供的具体技术方案是：一种制备灰树花蛋白聚糖的方法，，包括灰树花蛋白聚糖的提取、分离和纯化步骤，具体如下：

(1)诱导自溶：调节菌体浓度为1-10％(w/v)，之后添加占总量0.01-0.5％(w/v)的无机盐；用酸调节pH至4.5-6.0，在40-60℃条件下保温2-10h获得自溶溶液；

(2)酶解：将步骤(1)所得自溶溶液用碱调节pH至7.0-8.5，添加0.01-0.1％(w/v)酶制剂，在40-60℃条件下保温2-8h；90℃灭酶活，冷却后离心，收集上清液；

(3)膜分离：对步骤(2)所得的清液微滤，在进行超滤脱盐和浓缩；同时通过超滤调节浓缩液的离子强度，使浓缩液电导率在100μs/cm以下，并调节浓缩液蛋白聚糖浓度在1％左右；

(4)超滤浓缩液经过层析纯化、冷冻干燥等步骤，得到灰树花蛋白聚糖。

其中步骤(1)中所采用的菌体是灰树花液体发酵菌丝体或灰树花鲜子实体或两者的混合物，采用灰树花鲜子实体时预先进行破碎，破碎至破碎至粒径0.1-1.0cm，所添加的无机盐为硫酸镁、氯化镁、硝酸镁、碳酸钙、氯化钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钾中的一种或数种的混合物。

之所以采用这种方式，主要是在步骤(1)中，为诱导菌体自身内源酶系进行自溶提供激活的条件，在步骤(1)中的条件下，可以诱导灰树花菌体内源自溶酶的活性提高，产生自溶效果，将菌体中的内容物，包括灰树花蛋白聚糖更多的溶出。其主要作用机理是：

生物体细胞中存在一系列自溶酶，包括蛋白酶、脂肪酶、多种糖类水解酶，其中微生物体内的含量相对较高。在特定条件下(如特定的发育阶段等)生物体启动自溶系统，非重要器官或年龄较长的细胞发生自溶，自溶酶将细胞及其内容物分解为可被利用的营养物质以保证完成特定的发育阶段。用无机盐的形式添加镁、钙、钾等离子，补充灰树花菌体自身内源自溶酶体系的辅酶因子，即可激活酶促反应，增加酶活性，在促进菌体细胞自溶和细胞内容物大量释放的同时，也提高了目标产物的提取效率，并降低了能耗。