[发明专利]44个SNP位点多色荧光复合检测的方法及试剂盒

权利要求书

1.44个SNP位点多色荧光复合检测的试剂盒，其包括a)扩增体系：PCR缓冲溶液、MgCl₂、dNTPs、PCR引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA，b)扩增产物纯化试剂：核酸外切酶Ⅰ及其缓冲溶液、虾碱性磷酸酶及其缓冲溶液，c)延伸反应试剂：延伸引物和SNaPshot反应混合液，d)测试试剂：Hi-Di甲酰胺和GeneScan^TM Size Standards-120LIZ，其特征在于，所述PCR引物和延伸引物由44个SNP基因位点的引物组成，所述44个SNP基因位点在NCBI中SNP数据库的rs号分别为rs1109037，rs3780962，rs987640，rs9951171，rs430046，rs338882，rs2342747，rs10092491，rs1821380，rs321198，rs7041158，rs13218440，rs560681，rs445251，rs8078417，rs10488710，rs7520386，rs214955，rs4530059，rs13182883，rs722290，rs6811238，rs279844，rs9905977，rs6955448，rs4288409，rs315791，rs740598，rs2272998，rs7205345，rs10773760，rs221956，rs576261，rs1498553，rs2399332，rs1058083，rs993934，rs1336071，rs1294331，rs1523537，rs2269355，rs12997453，rs1736442和rs10776839。

2.根据权利要求1所述的44个SNP位点多色荧光复合检测的试剂盒，其特征在于所述44个SNP基因位点的PCR引物和延伸引物的序列参见表2。

3.根据权利要求1或2所述的44个SNP位点多色荧光复合检测的试剂盒，其特征在于同时复合扩增包含44个SNPs位点的DNA片段。

4.利用权利要求1所述的试剂盒进行个体识别的测试方法，其特征在于按照下列步骤进行：

a)提取DNA，得DNA提取液；

b)在扩增体系中加入步骤一所得的DNA提取液，然后在扩增仪中进行扩增，扩增条件为：95℃、5min预变性；然后依次在95℃、30s，60℃、30s，65℃、30s，进行35个循环；再在65℃保持7min；最终在4℃保存，获得扩增产物；

c)应用核酸外切酶Ⅰ和虾碱性磷酸酶纯化扩增产物，纯化反应条件：37℃、1h，然后80℃、15min，最终在4℃保存，得纯化后的扩增产物；

d)对纯化后的扩增产物进行延伸反应

将纯化后的扩增产物加入至所述的延伸反应试剂中进行延伸反应；所述的延伸反应的条件：依次在96℃、10s，50℃、5s，60℃、30s进行25个循环，最终保存在4℃，得延伸产物；

e)应用虾碱性磷酸酶纯化延伸产物

将延伸产物加入至虾碱性磷酸酶及其缓冲溶液的混合液中，在下列条件下进行纯化反应：37℃、1h，65℃、15min，最终保存在4℃，得纯化后的延伸产物；

f)检测、确定产物，

将步骤e)中得到的纯化后的延伸产物中加入至所述的测试试剂中，混匀；然后95℃变性3min，4℃迅速冷却后进行电泳检测；最后根据延伸产物峰的位置和颜色确定44个SNP基因位点的基因型。