[发明专利]一种耐甲硫氨酸的除虫链霉菌菌种筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物菌株筛选技术领域，具体是一种耐甲硫氨酸的除虫链霉菌菌种筛选方法。

背景技术

阿维菌素(avermectins，AVM)是由除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)产生的十六元环内酯类多组份抗生素，按其分子中C-5、C22-23、C26三个位置上的结构差异性可区分为A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a、B2b 8种组份。其中以B1组份，特别是B1a的抗线虫、节肢动物活性最高，而被广泛用于家畜寄生虫感染的治疗和农业虫害防治，成为农牧业的重要抗生素。阿维菌素分为8个活性组分，只有B_1a和B_1b可以做药用，尤以B_1a活性最高。阿维菌素合成代谢中C5-氧甲基化酶催化“B”组份成为“A”组份，使得甲基转移到“B”组份C5羟基上而成为A组份。S-腺苷甲硫氨酸是阿维菌素A组分C5位甲基的来源，通过筛选耐受甲硫氨酸能力强的菌株，提高代谢过程中甲硫氨酸的利用能力，减少甲硫氨酸参与菌体内S-腺苷甲硫氨酸的合成，进而减少了阿维菌素A组分的生物合成，提高了B组分的含量。以液体培养进行耐受性菌株的富集，再通过固体平板分离纯化进行耐受性菌株筛选，通过动态和静态筛选的结合，提高阿维菌素耐受甲硫氨酸的筛选效率。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种耐甲硫氨酸的除虫链霉菌菌种筛选方法，解决现有的菌种选育中大工作量且缺乏定向性的问题。

本发明的技术方案为：

一种耐甲硫氨酸的除虫链霉菌菌种筛选方法，包括以下步骤：

(1)、取生长好的除虫链霉菌斜面一支，作为出发菌种，向内加入适量纯化水，将除虫链霉菌斜面上的孢子刮下得孢子液，将孢子液中的孢子链打碎、过滤得除虫链霉菌单孢子悬液一；

(2)、将除虫链霉菌单孢子悬液一置于紫外线灯下经照射进行诱变处理，然后接入含2-3％甲硫氨酸的液体培养基中，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下培养4-6天，富集耐受2-3％甲硫氨酸的菌株；

(3)、将耐受2-3％甲硫氨酸的菌株接入斜面培养基，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下培养7-9天，然后从斜面培养基中取一支成熟斜面，向内加入适量纯化水，轻轻将成熟斜面上的孢子刮下，然后将孢子链打碎后过滤得耐受2-3％甲硫氨酸的除虫链霉菌单孢子悬液二；吸取除虫链霉菌单孢子悬液二稀释成10^-4，10^-5，10^-6梯度浓度，然后分别吸取稀释后的10^-4，10^-5，10^-6梯度浓度的除虫链霉菌单孢子悬液二0.18-0.22ml分别涂在含2-3％甲硫氨酸的平板上，在含2-3％甲硫氨酸的平板培养基中，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下培养5-8天；

(4)、从涂过稀释过的除虫链霉菌单孢子悬液二的上述平板上中选取菌落密度适宜、菌落形态好的平板，从此平板上挑取单菌落接种至斜面培养基，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下培养7-9天，然后从培养好的斜面培养基上挖下0.8-0.12cm²的菌苔接入种子培养基，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下摇瓶培养24-28h后，按发酵体积的10％接种到发酵培养基中，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下摇瓶培养240-280h，然后测定效价，挑选出效价比出发菌种效价高的菌株；

(5)、将步骤4挑选的效价较高的菌株接种至斜面培养基在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下培养7-9天，再从培养好的斜面培养基上挖下0.8-0.12cm²的菌苔接入种子培养基，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下摇瓶培养24-28h后，按发酵体积的10％接种到发酵培养基中，在温度27.5-28.5℃、湿度30-50％的条件下摇瓶培养240-280h，然后测定效价，挑选出效价比出发菌种效价高的菌株；