[发明专利]番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒和制备方法及其使用方法

权利要求书

1.一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒，其特征是包括有10×PCRBuffer 1管，2.5mM dNTPs 1管，5U Taq DNA聚合酶1管，5μM上游引物5′-TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3′200μL，5μM下游引物5′-TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3′200μL，去离子水1管，PBST洗液1管，番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠1管，体积为2～5mm×2～5mm×2～5mm的普通磁体1块，阳性对照1管。

2.一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒的使用方法，其特征是步骤为：

(1)病菌富集：取检测样品1mL置于离心管中，然后在每个离心管内加入50μL番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠，磁珠量为10⁵-10⁶个/mL，在摇床上室温摇动2h，转速为150rpm，然后将检测样品置于磁体上静置5min，待磁珠被收集到管壁的一侧时，用移液器小心吸去检测样品，然后再用PBST洗涤离心管3次，每次2min，在磁体上静置5min，然后弃去洗液；

(2)PCR扩增：将富集病菌后的免疫磁珠重悬于50μL去离子水中，离心混匀后再转移到PCR管内，然后放于PCR仪中，99℃热裂解15min，然后迅速转移到冰上冷却5min，再5000rpm离心2min，取其上清36.6μL转移至另一PCR管中，再在该管内加入再加入10×PCR buffer 5μL、2.5mM dNTPs4μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL、5μM上游引物5′-TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3′2μL，5μM下游引物5′-TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3′2μL，扩增条件为94℃2min；94℃30s，62.5℃45s，72℃45s，35个循环，然后72℃延伸7min，最后4℃保存，阳性样品可扩增出大小为270bp的特异性目标片段。

3.一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒特异性免疫磁珠的制备方法，其特征是步骤为：

(1)将N-羟基琥珀酰亚胺生物素溶于二甲基甲酰胺中，调整生物素浓度为50μg/mL；

(2)测定抗体的浓度，并用pH为9.6的碳酸盐缓冲液将抗体稀释到10μg/mL；

(3)按生物素与抗体的质量比为1∶10的比例混合，室温振荡反应4h；

(4)将透析分子量为8000-14000的透析膜剪成长度为5-10cm的小段，然后在500mL 2％的NaHCO₃和1mmol/L pH为8.0的Na₂EDTA·2H₂O中将透析膜煮沸10min，再用去离子水彻底清洗透析膜，然后放于1mmol/L Na₂EDTA·2H₂O中将之煮沸10min，冷却后放于4℃冰箱，确保透析膜始终浸没在溶液内，最后用去离子水将透析膜内外冲洗干净，结扎透析膜的一端后将生物素化的抗体移入透析袋中，然后再结扎透析袋的另一端，放于250mL PBS中透析过夜，期间更换缓冲液2次；

(5)将链霉亲和素磁珠用碳酸盐缓冲液洗涤3次，每次2min，然后在磁体上静置5min，弃去链霉亲和素磁珠保存液，链霉亲和素磁珠保存液为pH7.4，0.1％BSA和0.02％ NaN₃的溶液；然后将链霉亲和素磁珠重悬于相同体积的碳酸盐缓冲液中；

(6)将经过透析后的生物素化抗体全部转移至链霉亲和素磁珠储存管内，在振荡器上室温振荡2h，让链霉亲和素和生物素充分反应；

(7)将连接抗体后的磁珠在磁体上静置5min，去除未结合到链霉亲和素磁珠上的过量抗体，然后用PBST洗涤3次，每次2min，最后将连接抗化后的磁珠重悬于碳酸盐缓冲液中，从而制备出番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠。