[发明专利]番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒和制备方法及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种在番茄溃疡病菌基因水平上快速检测的试剂盒，属于植物检疫和植物保护领域，专一针对番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，Cmm)的检测。本试剂盒适用于番茄溃疡病的田间预防和出入境植物检疫及植物保护中番茄溃疡病菌的快速检测。

背景技术

番茄溃疡病(Bacterial canker of tomato)是影响番茄生产最重要的细菌性病害。该病分布广泛，在世界范围内已经广泛流行并造成了巨大的经济损失，在我国的东北、华北、西北及东部沿海等地均有发生，部分地区产量减少在80％以上，导致我国番茄产量锐减并造成了巨大的经济损失，同时严重威胁着我国外繁种子基地的健康发展。

番茄植株从幼苗到坐果期都可发病，发病的植株常表现为病苗矮化枯死、茎杆增粗溃疡、叶片坏死萎蔫、果实皱缩畸形等症状，严重影响了番茄的产量和品质，给各国番茄主要生产区造成了严重的经济损失。在苗期染病，症状初始于下部叶缘，随后向上蔓延引起整株叶片萎蔫，造成病苗矮化或枯死。在成株期染病，主要表现为植株叶片萎蔫、下垂、卷缩，植株茎杆产生狭长稍凹陷的开裂状条斑，茎杆增粗。病菌侵染种子时，通常表现为萎蔫，此时维管束受到严重破坏；病菌通过植株表面的毛孔、水孔等自然孔口侵染后，则会出现叶片边缘坏死、萎蔫等局部症状；病菌侵染维管束时，则造成果实皱缩、畸形；病菌侵染果实时则出现白色圆形小点，后变黄褐色，病斑中央粗糙突起，四周有白色晕圈，呈“鸟眼状”。在叶片，最初的症状是叶片出现可逆性的萎蔫，在叶片的叶脉之间产生白色随后转为褐色的坏死条斑，最后表现出永久性萎蔫，使整个植株干枯死亡。在田间，最初的症状主要是低位叶片的小叶边缘出现卷缩、下垂、凋萎、似缺水状，最后造成大片的缺株断垄，危害十分严重。

番茄溃疡病远距离广泛传播最主要的途径是种子中携带的番茄溃疡病菌，有研究表明0.01％的种子传病率就能引起该病的大面积流行。更有研究表明，导致病害在田间流行并造成较大经济损失的最主要原因是初侵染，而初侵染最重要的来源是种子带菌。至今，尚无成功防治该病害的抗病品种和有效的药物。因此，严格控制带菌种子流入市场是防止该病暴发的最重要的措施之一。但是，番茄种子的带菌率普遍较低，一般为1％，常规的检测方法常常导致漏检。目前国内外对番茄溃疡病菌检测采用的方法主要有育苗检测、分离培养检测、免疫血清学和PCR检测等方法。育苗检测、分离检测所需检测时间较长，无法满足多批次种子进出口检测要求；免疫血清学如ELISA检测灵敏度相对较低，且常有交叉反应，种子样品中的杂质和其他抑制剂等因素也使得PCR的检测灵敏度较低。因此，发展一种将病原富集技术和PCR高灵敏检测有效结合的方法，是出入境商用番茄种子快速检测急需解决的实际问题。

发明内容

本发明的目的在于避免现有技术的不足提提供一种番茄溃疡病菌快速免疫磁珠分离PCR(Immunomagnetic separation-PCR，IMS-PCR)检测试剂盒，以克服现有植物病原菌检测方法灵敏性低、特异性差、检测周期长的缺点。本发明是将免疫磁珠分离技术和分子生物学检测技术结合起来，首先利用免疫磁珠对番茄溃疡病菌进行富集，然后再利用分子生物学的高检测灵敏度，进行PCR扩增，从而建立了一种将免疫磁珠分离技术和分子生物学技术有机结合起来的检测方法。该方法检测灵敏度高、特异性强、方便快捷、能直接对带菌种子进行检测，同时省去了核酸提取的过程，降低了操作过程中病原的损失，极大地提高了检测的准确性和灵敏度，缩短了检测周期，是一种特别适用于番茄种子等植物材料中微量病原的检测方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒，其主要特点是包括有10×PCR Buffer 1管，2.5mM dNTPs1管，5U Taq DNA聚合酶1管，5μM上游引物5′-TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3′200μL，5μM下游引物5′-TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3′200μL，去离子水1管，PBST洗液1管，番茄溃疡病菌特异性免疫磁珠1管，体积为2～5mm×2～5mm×2～5mm的普通磁体1块，阳性对照1管。

所述的免疫磁珠购买于Promega公司。

一种番茄溃疡病菌快速IMS-PCR检测试剂盒的使用方法，其主要特点是步骤为：