[发明专利]用于表达异二聚体糖蛋白激素的表达框、表达载体及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于表达双亚基异二聚体重组糖蛋白激素的表达框、表达载体及其制备方法。

背景技术

利用生物技术表达生产有价值的重组蛋白一直是生物技术领域的热点问题。而异二聚体糖蛋白激素的高效表达一直是本领域的难题。

糖蛋白激素(Glycoprotein hormones)是指由垂体产生的促甲状腺素(TSH)、促黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)和由胎盘产生的绒毛膜促性腺激素(CG)，这些激素在性腺和甲状腺功能上具有重要作用。

这些糖蛋白激素都是由α亚基和β亚基构成的异二聚体。大多数高等脊椎动物只有一种编码α亚基的基因，同一种属的所有糖蛋白激素的α亚基是相同的，而且不同种属之间α亚基的氨基酸序列也有很高的同源性。β亚基具有激素特异性，每一种激素的β亚基是由不同基因编码。在糖蛋白分子中，亚基的结合对激素的功能是相当重要的，单个亚基不具有生物活性，实际上在哺乳动物细胞内α亚基和β亚基表达后再形成具有高激素活性的异二聚体。

糖蛋白激素在临床上得到了广泛的应用。TSH由垂体前叶促甲状腺细胞合成并分泌，其主要功能就是促进甲状腺滤泡上皮细胞增生、甲状腺激素合成和释放的作用，临床上主要用于在分化良好型甲状腺癌的甲状腺切除治疗。FSH、LH均在垂体前叶合成，二者合称为促性腺激素(gonadotropin)，临床上主要用于治疗不排卵妇女的不孕症和男性促性腺激素分泌不足或精小管缺陷。绒毛膜促性腺激素在胎盘内合成，其主要功能就是刺激黄体，有利于雌激素和黄体酮持续分泌，促进胎盘生长成熟。

早期的激素药物是从动物或人的尸体、体液、尿、内脏中提取的天然激素。由于激素在体内的含量很低，生化提取耗费很大而且纯度不高，所用原料也是易受病毒污染。DNA重组技术使激素类药物的规模生产成为现实。目前，国际上上市的重组糖蛋白激素类药物有重组人促卵泡激素(rhFSH)，重组人绒毛膜促性素(rhCG)，重组人促黄体激素(rhLH)，重组人促卵泡激素(rhFSH)，重组人促甲状腺素(rhTSH)。

目前重组异二聚体激素的生产主要采用如下策略：分别将α亚基和β亚基构建在不同的表达载体上，共转染哺乳动物细胞，再经大量的筛选获得工程细胞株，细胞株经培养和纯化得到高纯度的重组产品。该方法的缺点是两个亚基必须构建于不同的载体上，而且各自带有不同标志基因，共同转染后由于整合位点不同、表达合的丢失或失活，使其两个亚基的表达不同步或失衡，造成表达水平低，生产成本高和产品价格高，给患者带来经济负担。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是提供一种用于表达异二聚体糖蛋白激素(由α亚基和β亚基组成)的表达框。该表达框的结构为在启动子后可操作的连接有双亚基重组蛋白的各个亚基的编码序列，各个亚基的编码序列之间用内部核糖体进入位点序列IRES进行连接。所述可操作的连接，是指将基因编码序列连接于启动子后并由启动子控制其表达。

其中：上述用于表达双亚基重组蛋白的表达框所表达的目标蛋白为人糖蛋白激素。

其中，上述表达框的结构为启动子-β亚基-IRES-α亚基模式或启动子-α亚基-IRES-β亚基模式。

其中，上述表达框中α亚基的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示或为其简并序列。

其中，上述表达框中的β亚基的核苷酸序列为SEQ ID No.2(hFSH-β亚基)、SEQ ID No.3(hCG-β亚基)、SEQ ID No.4(hLH-β亚基)或SEQ ID No.5(hTSH-β亚基)中的任一项所示或为其简并序列。

其中，上述表达框中的启动子为CMV启动子或其它真核表达启动子。

其中，上述表达框中的内部核糖体进入位点序列为SEQ ID No.6所示或为其变体。

本发明的另一个目的是提供一种用于表达双亚基重组蛋白的的表达载体。该载体上连接有上述的表达框。

其中，上述表达载体为真核表达载体。

其中，上述表达载体为质粒表达载体或病毒表达载体。

其中，上述表达载体中有DHFR基因、或谷氨酰胺合成酶基因GS或抗生素抗性基因作为筛选标志基因。

进一步的，上述载体的核苷酸序列为SEQ ID No.7所示。

本发明的第三个目的是提供一种含有上述表达载体的宿主细胞。