[发明专利]一种神经坏死病毒的病毒类似物的制备方法

权利要求书

1.一种神经坏死病毒的病毒类似物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）在原核条件下，将已含有编码神经坏死病毒衣壳蛋白基因的 pQE30质粒载体的大肠杆菌，进行神经坏死病毒病毒类似物的表达；表达的条件为：将OD600=1.5的大肠杆菌菌液按照1%的质量分数接种到培养基中，于37 ℃，250 rpm下培养至OD600为0.3-0.5时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至异丙基-β-D-硫代半乳糖苷终浓度为900 μM，转移至25-30 ℃，200 rpm的转速下继续培养3-4小时完成表达；

（2）表达结束后，破裂菌体、分离及纯化获得神经坏死病毒的病毒类似物。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的培养基是Luria-Bertani培养基。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的破裂菌体是在表达结束后的菌液中加入Triton X-100至其终浓度为1%；再加入苯甲基磺酰氟至其终浓度为2 mM；混匀后冰上放置，再进行超声破碎。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的冰上放置时间为30分钟，每隔5分钟混匀一次；超声破碎总作用时间为30分钟，分次进行，每次连续超声10-15秒，停30秒。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的分离是将破裂后的菌液在40,000 g下离心10 min，收集上清。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的分离步骤所获得的上清液继续进行离心及上清的收集，共离心及收集3次获得上清。

7.如权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于所述的纯化包括初纯化和最终纯化；初纯化是将所述上清通过质量分数30%蔗糖垫进行超速离心，离心条件为250,000 g下离心1 h，弃上清；所述的最终纯化是初步纯化获得的沉淀以PBS充分重悬，重悬液通过等体积的质量分数为10%、20%、30%、40%的蔗糖梯度进行超速离心，离心条件为250,000 g下离心4 h。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的载体是重组了带组氨酸标签的神经坏死病毒基因的pQE30质粒。

9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述的纯化是将通过离心分离所得的上清粗提液与Ni-NTA柱料按1 L诱导后菌液体积比2 ml柱料的比例在4 ℃混合2 h，用含有20 mM咪唑的PBS洗涤液洗涤4次，每次使用3倍柱床体积。

10.最后用含有250 mM咪唑的PBS洗脱液以一个柱床体积将His-VLP进行洗脱，共洗脱3次。