[发明专利]一种神经坏死病毒的病毒类似物的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种神经坏死病毒病毒类似物的制备方法。

背景技术

鱼类的病毒性神经坏死病（viral nervous necrosis，VNN），又称病毒性脑病和视网膜病（viral encephalopathy and retinopathy，VER），每次病情暴发都给当地的孵苗场养殖场带来巨大经济损失，是水产养殖业发展的一大障碍。该病的致病原是β属诺达病毒（Betanodavirus），多种鱼类的仔鱼和稚鱼是其敏感宿主，病发后死亡率高达90%以上，甚至可达 100%。病毒的宿主种类遍布 16个科 40 多种鱼，大多数是海洋鱼类。近年来随着研究工作的推广和深入，报道发现β诺达病毒感染淡水鱼类的案例有增多的趋势。

近几年神经坏死病毒（NNV）的病毒类似物（virus-like particle，VLP）研究开展较多。当NNV的唯一结构蛋白，衣壳蛋白（cpasid protein，CP）也称α蛋白，在适当的环境下表达时，可以自身形成3聚体，并且60个3聚体会形成具有180个CP单体的病毒类似物（VLP）。不少文献已经证明，所形成的VLP与野生型病毒的蛋白三维构象非常类似；VLP是针对神经坏死病毒非常有用的免疫原；VLP是基因工程疫苗重要的候选抗原。但无论是用杆状病毒在真核细胞中表达还是原核状态的大肠杆菌表达，均集中在野生型表达优化的研究和通过缺失突变来研究形成VLP的重要氨基酸两大方面，但对如何方便有效的纯化VLP以达到工厂生产的需要方面还没有相关研究。成功生产了VLP后，如何快速低成本的纯化得到VLP成为另外一个重要的研究方向。一般VLP的纯化是用超速密度梯度离心的纯化方法（即类似病毒的纯化方法），纯化过程不但耗时而且花费大，不适合大规模纯化及生产。因此，作为基因工程疫苗免疫原要大规模生产纯化的问题急需解决。

发明内容

本发明的目的在于提供一种成本低、操作性强，并且适用于大规模纯化生产神经坏死病毒（NNV）的病毒类似物的方法。

发明通过以下技术方案实现上述目的：

发明提供了一种神经坏死病毒的病毒类似物的制备方法，包括以下步骤：

（1）在原核条件下，将已含有编码神经坏死病毒衣壳蛋白基因的 pQE30质粒载体的大肠杆菌，进行神经坏死病毒病毒类似物的表达；表达的条件为：将OD600=1.5的大肠杆菌菌液按照1%的质量分数接种到培养基中，于37 ℃，250 rpm下培养至OD600为0.3-0.5时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至异丙基-β-D-硫代半乳糖苷终浓度为900 μM，转移至25-30 ℃，200 rpm的转速下继续培养3-4小时完成表达；

（2）表达结束后，破裂菌体、分离及纯化获得神经坏死病毒的病毒类似物。

所述的培养基是Luria-Bertani培养基。

所述的破裂菌体是在表达结束后的菌液中加入Triton X-100至其终浓度为1%；再加入苯甲基磺酰氟至其终浓度为2 mM；混匀后冰上放置，再进行超声破碎。

所述的冰上放置时间为30分钟，每隔5分钟混匀一次；超声破碎总作用时间为30分钟，分次进行，每次连续超声10-15秒，停30秒。

所述的分离是将破裂后的菌液在40,000 g下离心10 min，收集上清。

所述的分离步骤所获得的上清液继续进行离心及上清的收集，共离心及收集3次获得上清。

所述的纯化包括初纯化和最终纯化；初纯化是将所述上清通过质量分数30%蔗糖垫进行超速离心，离心条件为250,000 g下离心1 h，弃上清；所述的最终纯化是初步纯化获得的沉淀以PBS充分重悬，重悬液通过等体积的质量分数为10%、20%、30%、40%的蔗糖梯度进行超速离心，离心条件为250,000 g下离心4 h。

本发明同时提供了另一种方案，与上述方案的区别在于采用了带组氨酸标签的神经坏死病毒衣壳蛋白基因，重组进质粒载体中，即载体是重组了带组氨酸标签的神经坏死病毒衣壳蛋白基因的pQE30质粒。

这种方案中，所采用的纯化步骤也区别于第一种方案，是将通过超声破碎后离心分离所得的上清粗提液与Ni-NTA柱料按1 L诱导后菌液体积比2 ml柱料的比例在4 ℃混合2 h，用含有20 mM咪唑的PBS洗涤液洗涤4次，每次使用3倍柱床体积。最后用含有250 mM咪唑的PBS洗脱液以一个柱床体积将His-VLP进行洗脱，共洗脱3次。

以下将更为具体的阐述本发明的方案：