[发明专利]小麦黄矮病毒的多重PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于植物病毒学技术领域，特别是涉及小麦黄矮病毒的多重PCR检测方法。

背景技术

小麦是全世界最主要的粮食作物之一，我国的种植面积居世界首位。但是，病毒病及其它病害严重影响了小麦的产量和质量。大麦黄矮病毒病(Barleyyellow dwarfvirus，BYDV)是一种全球性的病毒病害。每年对世界粮食生产造成一定程度的危害，大发生时会造成严重减产。在我国，该病主要流行于北方麦区，引起的小麦黄矮病是重要的流行病害。1987年仅陕西和甘肃两省就因该病害的流行损失5亿多公斤小麦，1998年大面积流行发生范围遍及陕西、山西、宁夏、内蒙和河北等多个省(自治区)。为了保证小麦生产的产量和质量，准确鉴定小麦病害，了解其流行动态，以尽早做好防范措施。因此小麦生产上急需一种较为灵敏、准确和快速的病害检测方法。

早期的检测方：生物学、血清学、电镜观察、核酸杂交和PCR技术都先后用于检测小麦病毒，但是一些传统的检测方法灵敏度不是很高，而且都只针对单一病毒的检测，对多种病毒混合检测时，需要耗费较多的时间和试剂。

多重PCR(M-PCR)是在普通PCR(polymerase chain reaction)的基础上加以改进，于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。与常规的单一PCR相比，多重PCR可以同时检测多种病害，极大地提高检测效率，降低检测成本。目前国内有单重和荧光PCR检测BYDV-PAV、GPV、GAV，而在田间经常表现为多种病害复合侵染；并且其症状极其相似，需要用分子方法进行区分。利用单一PCR对多种病毒进行系统检测的工作量较大，因而多重RT-PCR在小麦病害的检测中的优越性更为明显。

发明内容

本研究针对我国小麦病害发生的现状，利用设计的特异性引物对，摸索和优化多重PCR反应体系的条件参数等，建立了能从小麦叶片组织中同时检测BYDV种群PAV、GPV、GAV三种病毒的复合侵染田间样品的多重PCR检测方法。

具体的，本发明提供了一种利用多重PCR反应同时检测小麦黄矮病种群中PAV、GPV、GAV 三种病毒的方法，该方法包括小麦病毒总RNA的提取、逆转录反应制备cDNA模板，多重PCR反应，电泳检测，确定病毒种类，其特征在于逆转录反应制备cDNA模板应用引物SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.6，多重PCR反应中应用引物SEQ ID NO.1-6。

SEQ ID NO.1-6的核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.1：5’-ATGAATTCAGTAGGCCGTAGG-3’(PAV F)

SEQ ID NO.2：5’-CTATTTGGCCGTCATCAAGTG-3’(PAV R)

SEQ ID NO.3：5’-GGTCGCCCTTAGAAATG-3’(GPV F)

SEQ ID NO.4：5’-GCCTCGGTGATGAACTG-3’(CPV R)

SEQ ID NO.5：5’-GTAGAAATAACCGCAGGAG-3’(GAV F)

SEQ ID NO.6：5’-GACTTGAGTATTCCACCTGA-3’(GAV R)

上述方法中，优选地，在多重PCR反应的反应体系中，缓冲液浓度为0.4×-0.9×；dNTPs浓度为0.1-0.5mM；Mg²⁺浓度为1.0-3.5mM；退火温度为51-55℃；循环次数为20-45次；延伸时间为30-55s。

上述方法中，优选地，多重PCR反应的反应体系中，缓冲液浓度为0.4×、0.5×、0.6×、0.7×、0.8×或0.9×；dNTPs浓度为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM或0.5mM；Mg²⁺浓度为1.0mM、1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM或3.5mM；退火温度为51℃、52℃、53℃、54℃或55℃；循环次数为20、25、30、35、40或45次；延伸时间为30、35、40、45、50或55s。

上述方法中，更加优选地，多重PCR反应的反应体系中，缓冲液浓度为0.8×或0.9×，dNTPs浓度为0.4mM或0.5mM，Mg²⁺浓度为2.5mM或3.5mM，退火温度54℃，延伸时间45s，循环次数30次。

上述方法中，尤其优选地，多重PCR反应的反应体系中，TaqDNA聚合酶浓度为0.04U/μL-0.06U/μL。