[发明专利]蛭弧菌混合体在制备防治大菱鲆红嘴病菌剂中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种菌类的应用，特别涉及蛭弧菌蛭质体与游泳体混合物在大菱鲆红嘴病防治中的应用。

背景技术

大菱鲆(Scophthalmus maximus)是原产于欧洲的一种名贵鲆鲽类。它具有适应低水温生活，生长速度快，肉质好，养殖和市场潜力大等优点，相继成为欧洲各国开发的优良海水养殖鱼类之一。1992年引进中国，现已成为中国北方沿海重要的养殖品种。大菱鲆生长迅速，从产卵孵化到养成商品鱼出售(0.8-1斤)仅需10-12月时间，当年投资，当年获利受益，而且其经济价值高、饵料转换率高、抗病力强、耗氧量低、适合高密度养殖，是个很有发展前途的优良养殖品种。但是近年来，伴随着养殖范围的扩大和养殖密度的增加，大菱鲆的病害问题也日趋严重，红嘴病就是其中一种，给养殖业造成了巨大损失。大菱鲆“红嘴病”主要症状表现为：病鱼吻端及腹面上颌出血，部分鱼鳃盖有出血的溃烂小凹洞，口腔内出血，部分病鱼眼睛肿大突出、挑破外膜内有大量脓液，肠道充血无食物，肠道末端有少量粘稠液体，肝脏充血、色暗淡呈糜散状，脾脏肿大发红。在治疗过程中，养殖户为追求经济效益，胡乱用药等现象时有发生，致使农药残留问题日趋严重。因此，如何进行健康养殖，便成为的水产界亟待解决的问题。

蛭弧菌是寄生于其他细菌，并能导致宿主裂解的一类细菌。比一般细菌小，能通过细菌滤器，有类似噬菌体的作用。单细胞，呈弧形或逗点状，有时呈螺旋状，大小(0.2-0.6)×(0.8-1.2)微米，端生鞭毛，多为一根。革兰氏染色呈阴性，可以裂解致病或潜在致病性细菌。蛭弧菌的生活史分两个阶段：自由生活，能运动，不进行增殖的游泳体阶段和在特定宿主细菌的周质空间内进行生长繁殖的蛭质体阶段。蛭弧菌游泳体是指蛭弧菌侵入宿主细菌前的生长形式。蛭弧菌在游泳体阶段，识别并与宿主发生不可逆结合，然后侵入宿主，蛭弧菌游泳体侵入宿主细菌的过程非常快，一般几秒钟内即可完成。蛭弧菌蛭质体则是蛭弧菌在特定宿主细菌的周质空间内进行生长繁殖的形式。蛭弧菌进入宿主菌细胞周质空间后，主要通过降解宿主细胞的大分子成为单体，然后摄入用于其生物大分子的合成。随着细胞增殖和水解酶产生，使宿主细胞壁被破坏，从而裂解释放出蛭弧菌。

用蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合物作为预防和治疗大菱鲆红嘴病的一种新方法，兼具游泳体起效快，活力强和蛭质体制备、保存容易，杀菌作用时间更久和环境耐受力更强的优点，使得蛭弧菌混合物适合作为抑止或清除生物体及其环境中致病菌的生物净化因子，从而克服了抗生素滥用导致的药物残留问题。目前，用蛭弧菌游泳体和蛭质体的混合物来预防及治疗红嘴病的方法在国内外均未报道。

发明内容

为了克服鱼类养殖中滥用抗生素导致各种食品安全问题的不足之处，本发明提供一种蛭弧菌混合体在制备防治大菱鲆红嘴病菌剂中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

蛭弧菌混合体在制备防治大菱鲆红嘴病菌剂中的应用。

所述蛭弧菌混合体为蛭弧菌蛭质体和游泳体混合。

所述蛭弧菌混合体在制备防治大菱鲆红嘴病菌剂中的应用方法为：

(1)接种宿主于营养肉汤液体培养基中，在35℃和200rpm摇床培养12h，培养液经4℃，5000～8000rpm离心10～20min后，沉淀加入至DNB液体培养基中，接入蛭弧菌BDM01，在温度25～35℃下，以150～300rpm摇床培养36～48h，得到含蛭弧菌蛭质体和蛭弧菌游泳体的培养液，培养液在4℃温度下以6000～8000rpm离心15～20min后，去除含蛭弧菌游泳体的上清，得到的沉淀即为蛭弧菌蛭质体；将蛭弧菌蛭质体用DNB液体培养基、水、生理盐水或0.2mol/L pH值为7.2～7.6的磷酸盐缓冲液悬浮，得到浓度为10⁶～10⁹pfu/mL的蛭弧菌蛭质体菌液；

(2)将蛭弧菌蛭质体制备方法中的含蛭弧菌游泳体的上清经16000～18000rpm离心15～20min后，沉淀用DNB液体培养基、水、生理盐水或0.2mol/L pH值为7.2～7.6的磷酸盐缓冲液悬浮，得到浓度为10⁶～10⁹pfu/mL的蛭弧菌游泳体菌液。

(3)将蛭弧菌蛭质体菌液和游泳体菌液混合得防治大菱鲆红嘴病菌剂。

所述蛭弧菌为蛭弧菌(Bdellovibrio sp.)BDM01，于2008年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M208066。