[发明专利]一种提取棉花线粒体及其RNA的方法

权利要求书

1.提取棉花线粒体的方法，包括如下步骤：

(1)将棉花黄化苗的根进行液氮研磨，然后加入4℃预冷的溶液甲，振荡混匀，冰上静置2-30min；溶液甲由溶液A和蛋白酶K组成，蛋白酶K的浓度为0.01-1mg/mL；

(2)4℃、500-2000×g离心5-40min，取上清液；然后4℃、1000-4000×g离心5-40min，取上清液；然后4℃、8000-30000×g离心15-120min，取沉淀物；

(3)用溶液A洗涤重悬沉淀物，8000-30000×g离心15-120min，收集沉淀物，即为线粒体；

所述步骤(1)和步骤(3)中的溶液A由NaCl、Tris-HCl、EDTA-Na₂、DEPC水、PVP-40、BSA和β-巯基乙醇组成；溶液A中，NaCl的浓度为0.5-2.0mol/L，Tris-HCl的浓度为0.01-1.00mol/L，EDTA-Na₂的浓度为0.5-4mmol/L，PVP-40的浓度为0.5-5％(体积百分含量)，BSA的浓度为0.05-0.5％(体积百分含量)，β-巯基乙醇的浓度为1-10mmol/L。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，冰上静置的时间为2-5min或5-30min，优选为5min；所述步骤(3)中的离心条件为8000-16000×g离心15-40min或16000-30000×g离心40-120min，优选为16000×g离心40min；所述步骤(2)为：4℃、500-1000×g离心5-10min，取上清液；然后4℃、1000-2600×g离心5-15min，取上清液；然后4℃、8000-16000×g离心15-40min，取沉淀物；或所述步骤(2)为：4℃、1000-2000×g离心10-40min，取上清液；然后4℃、2600-4000×g离心15-40min，取上清液；然后4℃、16000-30000×g离心40-120min，取沉淀物；所述步骤(2)优选为：4℃、1000×g离心10min，取上清液；然后4℃、2600×g离心15min，取上清液；然后4℃、16000×g离心40min，取沉淀物。

3.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述棉花黄化苗的根、所述溶液甲和所述溶液A的配比为：5-10克棉花黄化苗的根∶5-45ml溶液甲∶5-50ml溶液A。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述棉花黄化苗的根、所述溶液甲和所述溶液A的配比为：5-10克棉花黄化苗的根∶5-30ml溶液甲∶5-20ml溶液A；或所述棉花黄化苗的根、所述溶液甲和所述溶液A的配比为：5-10克棉花黄化苗的根∶30-45ml溶液甲∶20-50ml溶液A；所述棉花黄化苗的根、所述溶液甲和所述溶液A的配比优选为：5克棉花黄化苗的根∶30ml溶液甲∶20ml溶液A。

5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述溶液A中，NaCl的浓度为0.5-1.2mol/L或1.2-2.0mol/L，Tris-HCl的浓度为0.01-0.05mol/L或0.05-1mol/L，EDTA-Na₂的浓度为0.5-2mmol/L或2-4mmol/L，PVP-40的浓度为0.5-2.5％(体积百分含量)或2.5-5％(体积百分含量)，BSA的浓度为0.05-0.1％(体积百分含量)或0.1-0.5％(体积百分含量)，β-巯基乙醇的浓度为1-5mmol/L或5-10mmol/L；所述溶液甲中，蛋白酶K的浓度为0.01-0.1mg/mL或0.1-1mg/mL；所述溶液A中，NaCl的浓度优选为1.2mol/L，Tris-HCl的浓度优选为0.05mol/L，EDTA-Na₂的浓度优选为2mmol/L，PVP-40的浓度优选为2.5％(体积百分含量)，BSA的浓度优选为0.1％(体积百分含量)，β-巯基乙醇的浓度优选为5mmol/L；所述溶液甲中，蛋白酶K的浓度优选为0.1mg/mL。

6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述棉花为陆地棉鄂抗棉12或中棉所12。

7.一种提取棉花线粒体RNA的方法，是将权利要求1至6中任一所述方法得到的棉花线粒体提取RNA，得到棉花线粒体RNA。