[发明专利]一种提取棉花线粒体及其RNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物生物技术，具体涉及一种提取棉花线粒体及其RNA的方法。

背景技术

线粒体(mitochondria)是高等生物最重要的细胞器，是细胞质半自主的遗传系统之一。线粒体是生物进行呼吸的重要细胞器，具有相对独立的遗传物质，同时受到细胞核基因的调控。植物细胞中，线粒体RNA仅占总RNA的约1％。因此，分离出高纯度的线粒体RNA(mtRNA)，对于构建线粒体的cDNA文库、研究线粒体的转录本等都是必需的。

棉花组织细胞富含棉酚、丹宁等次生代谢产物，极易被氧化；在其组织细胞破碎时这些次生代谢产物能与DNA或RNA结合形成稳定的粘稠褐色复合物。因此，和其他一些作物相比，棉花线粒体DNA和线粒体RNA的提取都较为困难，目前还没有关于棉花mtRNA提取方法的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种提取棉花线粒体及其RNA的方法。

本发明提供的提取棉花线粒体的方法，包括如下步骤：

(1)将棉花黄化苗的根进行液氮研磨，然后加入4℃预冷的溶液甲，振荡混匀，冰上静置2-30min；溶液甲由溶液A和蛋白酶K组成，蛋白酶K的浓度为0.01-1mg/mL；

(2)4℃、500-2000×g离心5-40min，取上清液；然后4℃、1000-4000×g离心5-40min，取上清液；然后4℃、8000-30000×g离心15-120min，取沉淀物；

(3)用溶液A洗涤重悬沉淀物，8000-30000×g离心15-120min，收集沉淀物，即为线粒体；

所述步骤(1)和步骤(3)中的溶液A由NaCl、Tris-HCl、EDTA-Na₂、DEPC水、PVP-40、BSA和β-巯基乙醇组成；溶液A中，NaCl的浓度为0.5-2.0mol/L，Tris-HCl的浓度为0.01-1.00mol/L，EDTA-Na₂的浓度为0.5-4mmol/L，PVP-40的浓度为0.5-5％(体积百分含量)，BSA的浓度为0.05-0.5％(体积百分含量)，β-巯基乙醇的浓度为1-10mmol/L。

所述步骤(1)中，冰上静置的时间为2-5min或5-30min，优选为5min；所述步骤(3)中的离心条件为8000-16000×g离心15-40min或16000-30000×g离心40-120min，优选为16000×g离心40min；所述步骤(2)为：4℃、500-1000×g离心5-10min，取上清液；然后4℃、1000-2600×g离心5-15min，取上清液；然后4℃、8000-16000×g离心15-40min，取沉淀物；或所述步骤(2)为：4℃、1000-2000×g离心10-40min，取上清液；然后4℃、2600-4000×g离心15-40min，取上清液；然后4℃、16000-30000×g离心40-120min，取沉淀物；所述步骤(2)优选为：4℃、1000×g离心10min，取上清液；然后4℃、2600×g离心15min，取上清液；然后4℃、16000×g离心40min，取沉淀物。

所述棉花黄化苗的根、所述溶液甲和所述溶液A的配比为：5-10克棉花黄化苗的根∶5-45ml溶液甲∶5-50ml溶液A。所述棉花黄化苗的根、所述溶液甲和所述溶液A的配比为：5-10克棉花黄化苗的根∶5-30ml溶液甲∶5-20ml溶液A；或所述棉花黄化苗的根、所述溶液甲和所述溶液A的配比为：5-10克棉花黄化苗的根∶30-45ml溶液甲∶20-50ml溶液A；所述棉花黄化苗的根、所述溶液甲和所述溶液A的配比优选为：5克棉花黄化苗的根∶30ml溶液甲∶20ml溶液A。