[发明专利]含基底膜的组织工程皮肤及其构建方法

权利要求书

1.一种含基底膜的组织工程皮肤的构建方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

A)分离、培养角朊细胞、成纤维细胞；

B)表面修饰改性羊膜：

去除绒毛膜后的羊膜，经生理盐水反复浸泡、清洗后，于0.02％的EDTA溶液37℃消化2小时，超声振荡洗涤彻底除去残留的细胞碎片及绒毛膜组织，置于含1000U/ml庆大霉素、2.5g/ml两性霉素B的生理盐水中浸泡20至50分钟；

C)构建组织工程皮肤；

将B)步骤制备的羊膜与含成纤维细胞的血浆基质复合，再将角朊细胞以1-5×10⁵个/cm²的密度接种于羊膜表皮面，体外培养2-3周。

2.根据权利要求1所述的含基底膜的组织工程皮肤的构建方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：

A)分离、培养人角朊细胞、成纤维细胞：

利用包皮环切术后废弃包皮组织，采用酶消化法分离、培养角朊细胞、成纤维细胞，分别制备成单细胞悬液，按2-3×10⁵个/ml细胞密度接种于培养瓶中，置于37℃培养箱中，角朊细胞以无血清培养基培养，成纤维细胞以完全型DMEM培养液进行培养，当细胞达70％-80％融合时进行传代、扩增；

B)表面修饰改性羊膜：

无菌条件下剥离新鲜羊膜，钝性分离绒毛膜，经生理盐水反复浸泡、清洗后，于0.02％的EDTA溶液中，37℃消化2小时，随后放入高频超声清洗器中超声振荡洗涤2小时，彻底除去残留的细胞碎片及绒毛膜组织，然后经蒸馏水反复浸泡清洗后，置于含1000U/ml庆大霉素、2.5g/ml两性霉素B的生理盐水中浸泡30min备用；

C)构建组织工程皮肤：

将步骤B)制备的羊膜基底面向上铺于培养板上，待其完全干燥贴壁，取患者或异体全血置于含枸橼酸钠抗凝剂的抗凝管中，600g离心5min，收集血浆，经20um孔径的过滤器消毒除去细胞碎片，将成纤维细胞加入制备的血浆中配制浓度为5×10⁵个/ml，充分混匀后，以1∶6的体积(ml)与培养板面积(cm²)比将含成纤维细胞的血浆加入上述铺有羊膜的培养皿中。随后以1∶40的体积比加入1M的氯化钙溶液，待其聚合成凝胶后，加入含20％胎牛血清的1×DMEM溶液，于体外培养3-5天；随后将角朊细胞按1-5×10⁵个/cm²的密度接种于羊膜上，待细胞融合后，进行气-液界面培养2-3周，每2～3天换液一次。

3.一种如权利要求1或2所述的方法构建的组织工程皮肤。

4.如权利要求3所述的组织工程皮肤在制备创面修复移植材料中的应用。