[发明专利]含基底膜的组织工程皮肤及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程和医学创面修复技术领域，具体涉及一种将羊膜表面修饰改性后作为基底膜，复合血浆为基质，经体外培养构建含基底膜的组织工程皮肤(即活性皮肤替代物)，特别适用于烧伤、创伤的皮肤缺损修复及瘢痕整形。

背景技术

目前，以聚乳酸、聚羟基乙酸、胶原、透明质酸等生物可降解材料构建真皮支架，在此基础上构建活性皮肤替代物，已初步应用于深度皮肤缺损创面的修复及疤痕整形等。但由此构建的皮肤替代物一方面基质材料提取困难，制作工艺复杂，费用昂贵，难以在临床广泛推广应用，另一方面其不具备皮肤的基底膜结构，导致愈合皮肤不耐压和耐磨，表皮粘附不牢，容易脱落破损或形成水疱，且影响正常表皮结构、形态的发育。而异体脱细胞真皮取自尸体皮，来源有限，价格昂贵，限制了其临床推广应用。

人羊膜组织为含单层上皮细胞的半透明组织，无血管、神经、淋巴管，厚度为0.02-0.5mm，其基底膜的形态与皮肤基底膜非常相似，且主要由层粘连蛋白和IV型胶原组成(赵敏，鲁静，张琪，等.HGF、bFGF、ColIV、LN在保存羊膜中的表达.眼科研究，2006，24(5)：514-517.)。此外人羊膜是医疗废弃组织，来源广泛，取材方便，其作为一种生物敷料较早用于烧伤创面的覆盖，不仅可以降低创面的炎症促进上皮化而且可以抑制瘢痕的形成。目前已有商品化的羊膜产品如江西瑞济生物工程技术有限公司的冷冻干燥生物羊膜。

国内外尚无文献报道将羊膜作为基底膜，复合血浆为基质，经体外培养构建含基底膜的组织工程皮肤。

发明内容

本发明目的在于提供一种以表面修饰改性的羊膜为基底膜，，以自体/异体血浆为基质的皮肤替代物，及其构建方法。本发明材料来源广泛，制备方法简单，成本低廉，可在体内移植中保持完整的基底膜和半桥粒，加速并促进表皮结构形态的形成。

本发明的以表面修饰改性的羊膜为基底膜，血浆为基质的含基底膜的组织工程皮肤的构建方法，包括如下步骤：

A)分离、培养角朊细胞、成纤维细胞(参考：刘德伍，李国辉，邹萍，刘德明.表皮细胞、成纤维细胞复合脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤.中国临床康复，2004，8(8)：1439-1441.)。

B)表面修饰改性羊膜：

去除绒毛膜后的羊膜，经生理盐水反复浸泡、清洗后，于0.02％的EDTA溶液37℃消化2小时，超声振荡洗涤彻底除去残留的细胞碎片及绒毛膜组织，置于含1000U/ml庆大霉素、2.5g/ml两性霉素B的生理盐水中浸泡20至50分钟。

C)构建组织工程皮肤；

将B)步骤制备的羊膜与含成纤维细胞的血浆基质复合，再将角朊细胞以1-5×10⁵个/cm²的密度接种于羊膜表皮面，体外培养2-3周。

本发明的构建方法具体步骤如下：

1、分离、培养人角朊细胞、成纤维细胞

利用包皮环切术后废弃包皮组织或者整形术后多余皮肤组织，分别采用酶消化法及组织块贴壁法分离、培养角朊细胞和成纤维细胞。分别制备成单细胞悬液，按2-3×10⁵个/ml细胞密度接种于培养瓶中，置于37℃培养箱中，角朊细胞以无血清培养基培养，成纤维细胞以完全型DMEM培养液进行培养，当细胞达70％-80％融合时进行传代、扩增。

2、表面修饰改性羊膜

无菌条件下剥离新鲜羊膜(取自肝炎病毒抗体、梅毒抗体及HIV均为阴性的剖腹产妇的胎盘组织)，钝性分离绒毛膜，经生理盐水反复浸泡、清洗后，于0.02％的EDTA溶液中，37℃消化2小时，随后放入高频超声清洗器中超声振荡洗涤2小时，彻底除去残留的细胞碎片及绒毛膜组织，然后经蒸馏水反复浸泡清洗后，置于含1000U/ml庆大霉素、2.5g/ml两性霉素B的生理盐水中浸泡30min制备表面修饰改性的羊膜。

3、构建组织工程皮肤

首先将制备的羊膜基底面向上铺于培养板上，待其完全干燥贴壁。取患者或异体全血后离心获取血浆，经微孔过滤器除去细胞碎片，将成纤维细胞加入制备的血浆中配制浓度为5×10⁵个/ml，充分混匀后加入上述铺有羊膜的培养皿中。随后以1∶40的体积比加入1M的氯化钙溶液，促进其聚合，待其聚合成凝胶后，加入含20％胎牛血清的1×DMEM溶液，于体外培养3-5天。随后将角朊细胞按1-5×10⁵个/cm²的密度接种于羊膜上，待细胞融合后，进行气-液界面培养2-3周，每2～3天换液一次，形成以羊膜为基底膜，血浆凝胶为基质的活性皮肤替代物。