[发明专利]一种高效纯化金属离子结合蛋白的离子交换层析分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质的分离纯化方法，特别是涉及一种使用新型离子交换层析纯化金属离子结合蛋白的分离纯化方法。

背景技术

许多蛋白质中含有金属离子辅基，这些金属离子对蛋白质的结构和性质具有重要的意义。金属离子结合蛋白质的纯化过程存在一些困难，在纯化过程中金属离子的丧失会导致蛋白质丧失天然结构，并进一步影响该蛋白质在离子交换层析过程中同其它杂蛋白的分辨率。

发明内容

本发明的目的是提供一种纯化金属离子结合蛋白的新型离子交换层析纯化方法。

本发明采用的技术方案步骤如下：

1)选取含有金属离子结合蛋白的待分离原料，沉淀离心去除脂类等杂质后收集上清液获得蛋白混合物；

2)在所得蛋白混合物中添加适量的蛋白结合金属离子；

3)选择不与蛋白结合金属离子沉淀的缓冲液作为离子交换层析缓冲液；

4)在离子交换层析缓冲液中添加适量的蛋白结合金属离子；

5)将蛋白混合物经过离子交换层析和凝胶过滤层析联用的组合层析，分离得到金属离子结合蛋白。

本发明所述的待分离原料为转基因动物乳液、转基因工程菌的发酵液、转基因动物细胞的发酵液等，优选为转基因哺乳动物乳液，所述的金属离子结合蛋白优选为转基因人源α-乳清白蛋白、乳转铁蛋白等；以下仅以一种蛋白的分离来加以说明，但本发明的保护不局限与此；牛乳中总蛋白浓度为30-38g/L，重组人源乳清蛋白浓度0.5-4.0g/L，优选蛋白浓度为1.0-3.5g/L。

本发明所述的沉淀方法可采用酸性沉淀、凝乳酶沉淀或硫酸铵沉淀的方法。在采用酸性沉淀时，需在室温下将待分离原料调节pH到3.5-5.5，优选的pH值为4.0-5.0，静置15分钟，离心收集上清液。在采用凝乳酶法时，向待分离原料中加入浓度为5％的凝乳酶溶液，牛乳与凝乳酶溶液体积比例为20-500∶1，优选的比例为50-200∶1，室温下反应10分钟，离心收集上清液。在采用硫酸铵沉淀方法时，调节待分离原料的pH到5.0-10.0，优选的pH值为6.0-8.0，并通过加入硫酸铵粉末使得乳清中硫酸铵饱和度为20％-60％，以摩尔数计为0.86-2.95M，优选的硫酸铵饱和度为30％-60％，以摩尔数计为1.33-2.37M，振荡2小时，离心收集上清液或收集沉淀并使用20mM磷酸盐缓冲液复溶后备用。

本发明所述的蛋白结合金属离子为钙离子、三价铁离子等，在蛋白混合物和离子交换缓冲液中的添加浓度优选为1-50mM。蛋白结合金属离子有利于保持金属离子结合蛋白的空间结构，有效地提高其在离子交换层析分离纯化中的分辨率。

本发明所述的离子交换层析中，离子交换层析介质采用琼脂糖材料为基质，所述的配基可为DEAE、Q、SP等，优选为DEAE。

本发明所述的离子交换层析中，可用的缓冲体系为Tris-HCl缓冲液，甘氨酸-HCl缓冲液和甘氨酸-NaOH缓冲液，优选的缓冲体系为Tris-HCl缓冲液；低盐缓冲液优选为20-100mM，pH6.0-8.0的Tris-HCl缓冲液，添加蛋白结合金属离子浓度优选为1-50mM；高盐缓冲液优选为20-100mM，pH6.0-8.0的磷酸盐缓冲液，洗脱盐浓度为0.5-2.0M，优选浓度为0.6-1.2M，添加蛋白结合金属离子浓度优选为1-50mM。

本发明所述的离子交换层析中，将处理得到的蛋白混合物溶液调节pH到5.0-10.0，优选的pH值为6.0-8.0。

本发明所述的离子交换层析中，本领域技术人员可根据金属离子结合蛋白的种类选择合适的离子交换层析介质、层析柱和进样速度将经预处理后的蛋白混合物溶液进样到用低盐缓冲液平衡好的离子交换层析柱中，层析过程使用280nm紫外吸收波长进行蛋白质的检测，进样的蛋白混合物溶液体积为0.5-5.0倍层析柱体积，优选为1.0-3.0倍层析柱体积。

本领域技术人员可调节工艺参数以得到不同的金属离子结合蛋白的初步纯化产品或纯品；由于本发明的离子交换层析过程中添加适量的蛋白结合金属离子，从而有效的保持金属离子结合蛋白的天然结构，通过本步骤可以有效地纯化金属离子结合蛋白。

本发明所述的凝胶过滤层析中，将金属离子结合蛋白的初步纯化产品再经凝胶过滤层析除去剩余杂质以得到纯品，凝胶过滤层析介质为琼脂糖介质，优选为Superdex 75。